直面病毒,不惧前行｜HIV病毒特点及其检测进展
助力人类早日战胜HIV病毒！
01
HIV病毒-人类至今难以战胜的杀手
7月6日-10日，第23届世界艾滋大会2020（AIDS2020）因为疫情召开有史以来第一次线上会议，会议主题围绕着新冠疫情对艾滋防治的影响。
7月6日，联合国宣布2020抗艾目标无法实现，新冠可能使抗艾进展偏离轨道[1]；2015年以来，全球比预定目标额外增加了350万人感染艾滋病病毒，82万人死于艾滋病相关疾病，此外，如果新冠肺炎大流行严重影响艾滋病毒防治服务，抗艾进展可能会进一步推迟10年或更长时间。
3月10日，权威医学期刊《柳叶刀》的子刊The Lancet HIV上，发表了一篇论文—确认了世界上第2例被治愈的艾滋病患者“伦敦病人”[2]，距离上一個艾滋病“被治愈“的案例“柏林病人”，已经过了14年了。是否意味着人类攻克了艾滋病？这是一个努力方向，但现在离攻克艾滋病还很远。因为“柏林病人”与“伦敦病人”的治疗方案并不适用于全部的艾滋病人。
02
HIV病毒至今一直是人类难以战胜的杀手！
HIV病毒全名为Human Immunodeficiency Viruses，中文为人类免疫缺陷病毒。HIV是一种逆转录病毒，是以RNA贮存遗传信息的病毒。当病毒进入宿主靶细胞后，释放出RNA和逆转录酶，然后以病毒RNA为模板逆转录DNA。之后病毒DNA被整合到宿主细胞DNA中。反过来又作为人细胞模板，由人DNA模板再转录出RNA[因此，这个术语“逆转（retro）”是指“回转（backward）”的意思]。因此，HIV被称作逆转录病毒，指的就是这一逆向（反向）程序。其他RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒（polio），或麻疹病毒（measles）不会产生DNA拷贝而仅仅是拷贝自身的RNA。它们仅复制自身的RNA，生成RNA拷贝。
宿主细胞每分裂一次，就会随着它自身的基因产生一份新的整合的病毒DNA，HIV的DNA拷贝以下述某一形式存在于体内：1.潜伏（潜藏）：病毒存在于体内但不导致伤害。2.活动性：这些新的病毒也可以从被感染的细胞内释放出来侵入其他细胞。
HIV会逐步破坏某些类型的白细胞，这些白细胞被称为CD4+T淋巴细胞。淋巴细胞可帮助机体抵御外来细胞、感染性微生物和癌症。因此，当艾滋病毒破坏CD4+T淋巴细胞后，人会变得极易受到许多其他感染性微生物的攻击。HIV感染的许多并发症，包括死亡，通常都是其他微生物感染所致，而非HIV病毒本身所致。获得性免疫缺陷综合征（AIDS）也就是俗称的艾滋病是最严重的HIV感染形式。
03
从发现病毒到发明检测
自1981年美国发现第一例艾滋病患者，1983年法国科学家首次分离出艾滋病毒，1985年中国出现首例艾滋病病例，1986年世界卫生组织将艾滋病的病原体统一命名为"人类免疫缺陷病毒"，至今已有将近40年的历史。
随着HIV感染者和临床患者数量不断增多、感染人群不断变化，对其诊断、筛查以及监测的需求不断增加，HIV检测技术和试剂不断进步，使HIV检测的窗口期越来越短，这也大大减少了高危人群因等待而恐惧的时间。
最初在80~90年代由于对艾滋病的研究尚处于起步阶段，玛蒂尔德·克里姆博士（MathildeKrim，Ph.D）所领导的全美艾滋病研究基金会（AMFAR）在早期的艾滋病研究中提出了艾滋病窗口期为3个月的概念[3]，这是针对当时较为落后的检测手段而言，该说法被世界卫生组织所采纳，同时被编写入世界各国的医学教科书。
第1到5代试剂HIV检测：
1985年美国FDA批准了第一个试剂盒，以Abbott为代表的第1代试剂所使用的抗原主要为HIV全病毒裂解抗原、固相抗原，采用间接酶联法检测血中lgG抗体[4]。第1代ELISA检测试剂的产生对HIV检测具有重大意义，但由于第1代试剂包被抗原为病毒裂解物且源自宿主细胞，纯化困难，易出现假阳性反应，并有一定污染风险，存在试验敏感性和特异性不高的缺点，窗口期约为10周。
80年代末以及90年代初，以美国Abbott和法国Pasture生产的第2代试剂是采用人工合成多肽及基因工程固相抗原，仍采用间接酶联法检测HIV-1和HIV-2 IgG抗体[4]。第2代试剂试验检测的敏感性和特异性较第1代明显提高，窗口期也缩至4-5周。
自90年代以来，以美国Abbott、荷兰Agzon及英国Wellcome公司为代表的第3代试剂则成功地采用基因工程固相抗原及标记的双抗原夹心酶联法测定血中抗体，酶标记物由第1、2代标记IgG抗体改为标记HIV特异性抗原，采用双抗夹心法检测HIV-1和HIV-2的IgG、lgM、lgA等不同抗体亚型[4]。第3代试剂不需过度稀释标本就具有较高的特异性和敏感性，窗口期缩至25天[5]。
第4代试剂仍采用双抗夹心法，并将包被物增加了HIV的p24抗原、抗体，所以第4代试剂检测标志物在第3代基础上因增加HIV-p24抗体、抗原的检出，其试验灵敏度也优于第3代试剂，检测成本也更为低廉，操作也更简便，窗口期进一步缩短至2周左右。2010年，美国Abbott公司也提供当时全球第一个获得FDA批准的第4代HIV检测试剂[6]。
2015年，美国FDA批准了Bio-Rad BioPlex2200HIVAg/Ab第5代HIV检测试剂[7]，虽其号称“第5代”，但其与第4代试剂检测标的相同，可检测HIV-1/2抗体和HIVp24抗原，但其不同在于可对HIV-1抗体，HIV-2抗体及p24抗原给出分开结果，目前尚无明显证据证实“第5代”试剂相比第4代试剂可缩短检测窗口期，因此还没有真正严格意义上的“第5代”试剂[8]。
HIV检测试剂进展[9]
从酶联免疫法到化学发光法：
酶联免疫试验（ELISA）作为HIV感染的筛查试验，其实验原理成熟，操作简便，试验特异性、准确性、敏感性都较，结果判断指标客观、便于纪录和保存等优点，既可于单个样本的测定，也适合批标本检测。但是检测时间较，容易受非特异性蛋扰，要求，若试剂开封不及时应，会影响准确性，对其准确率产影响。
化学发光免疫分析法（CIA）为双抗夹心法，将固相载体上包被HIV特异性抗原或抗体，加入标本及荧光或酶标记的抗原或抗体，继续加入发光或荧光底物，通过测定仪测定发光强度来判断标本中HIV-1、HIV-2抗体以及HIV-p24抗原的含量，CIA法测定的窗口期与第4代试剂ELISA相同。
CIA法检测HIV早期感染阳性率及试验敏感度均高于ELISA。CIA法具有较高的灵敏度、特异性及高阳性率，所以对HIV早期筛查具有良好的诊断价值[10]。CIA技术的缺点是实验过程中易产生假阳性结果，且对试验标准曲线界点的判断要求精准，所以对实验人员技术、经验要求较高。
核酸检测：
核酸检测也称聚合酶链反应检测（PCR）：核酸扩增试验指的是释放基因物质并用聚合酶链反应检测。PCR用于直接检测HIV的核酸物质，在感染两至三周内就能从血液中检测出HIV病毒。这种方法还可以用于测试血液中的病毒含量，为治疗提供依据。但是它既昂贵又复杂。
HIV核酸检测分为定性和定量试验。HIV核酸定性检测主要采用实时荧光定量PCR方法，HIV核酸定量检测主要基于靶核酸扩增和信号放大两种方法。定性和定量检测均可用作HIV感染诊断，定量检测还可用于抗病毒治疗效果监测。
HIV-1核酸定性检测包括RNA检测和DNA检测。RNA检测主要是检测血浆或血清中的RNA，DNA检测主要是检测全血、干血斑或组织细胞中的前病毒DNA或总核酸。二者相比，HIV-1 DNA检测的稳定性更好。
HIV-1核酸定量检测分为RNA检测和DNA检测。RNA检测主要是定量检测血浆中的病毒RNA，检测的主要原理是实时荧光定量PCR（RealTime-PCR）。主要步骤包括提取、纯化血浆中的病毒RNA，逆转录，进行PCR扩增，通过实时荧光定量PCR检测得到结果。
DNA检测包括全血、干血斑、PBMC及组织中DNA检测。血液中总HIV-1 DNA含量测定是目前最常用的方法。同定性检测一样，总HIV-1 DNA含量测定主要有荧光探针PCR法及以焦磷酸化激活聚合酶（PAP）反应为基础的核酸扩增PCR方法。针对整合的HIV-1 DNA的检测方法主要有Alu-gag PCR法，但由于灵敏度低等缺点未在临床上广泛应用[11]。
现有HIV商品化检测试剂的灵敏度和特异性不断提升，窗口期不断缩短，对不同性别和组别病毒的检测能力也不断增强。同时快速检测技术、以及核酸检测也有了新的突破，并实现了全自动化的检测流程。
04
HIV检测的挑战：病毒突变及遗传多样性
尽管HIV病毒检测技术进步如此迅猛，人类仍面临着HIV-1型病毒超常的遗传多样性和超快的进化速度带来的巨大挑战。
HIV病毒的遗传多样性主要有三个来源：
★来自以非人类的灵长类动物为宿主的，跨物种的慢病毒（类人猿免疫缺陷病毒，SIV）。事实上，HIV-1型病毒和HIV-2型病毒的SIV相对物，已有至少11次被引入人体。
★逆转录酶缺乏校对能力，导致转录容易出错，高水平的病毒复制（100亿次/天）又加剧了转录错误，导致总体遗传多样性每年增加大约1%。
★HIV-1型病毒复制所固有的重组特性、以及大量基因序列的交换，会导致其组成发生彻底的改变。
HIV-1型分M组、O组、N组和P组四个主要组群。M组占绝大多数，M组可细分为A到K的亚型，以及亚型内重组病毒株。
目前，有102个公认的流行重组体（CRF）[12]。新近研究表明，全球20%的感染病例为HIV-1型病毒的重组体。由于移民、旅游和军事部署在内的各种因素，导致病毒组型、亚型和流行重组体在全球的地理分布不断的演变。在HIV-1型病毒组群和亚型之间，有大量的序列多样性。例如，在亚型之间，有20%-30%的包膜蛋白序列差别，在组群之间可高达50%。
如此高水平的序列多样性有可能影响检测试剂的表现，因此对筛查、诊断和监测的检测试剂提出了巨大的挑战，自然多态性会带来关键抗原表位的氨基酸变化，从而导致免疫检测试剂灵敏度降低或漏检，而引物和/或探针结合位点的自然多态性会影响HIV病毒分子检测中的杂交效率，也会降低核酸检测灵敏度，甚至导致漏检。
由于全球一体化发展，伴随人口的快速流动性，HIV-1型病毒持续多样性以及全球分布的特性，使得病毒株的变异以及流行变得更加频繁，因此研发针对所有艾滋病病毒感染的可靠检测试剂势在必行。
意识到该问题的严重性，雅培在1994年主动发起HIV全球监测项目，旨在监测艾滋病毒的全球多样性，搜集新的变异株，并将遗传多样性、地域多样性的感染标本制备成血清盘，以研发出能够可靠检出所有HIV病毒株的试剂。
迄今为止，该项目已分析了200多个O组、11个N组和1个P组毒株。雅培是全球第二家可以识别N组和P组毒株的实验室，N组和P组毒株的识别异常困难，它们的流行率非常低，喀麦隆N组和P组的感染率分别是0.1%和不到0.01%。对于试剂的研发和性能验证来说，建立大样本量的全球性的血清盘至关重要，该项目已收集来自非洲、亚洲、欧洲、中东及南美地区16个国家的数以千计的HIV感染者的样本。地域和遗传方面的多样性由英格兰和西班牙的实验点完成，它们同时监测了移民人群以扩大覆盖面。
2019年11月，雅培宣布发现了一种人类免疫缺陷病毒（HIV）的新亚型病毒，称为M组HIV-1，亚型L13。这项研究标志着自2000年HIV病毒株分类指南制定以来，人类在21首次发现“M组”HIV病毒的新亚型病毒，也是人类自进入21世纪以来所发现的首个HIV新毒株。
雅培HIV全球监测项目的创立及持续投资，反映了雅培长期致力于HIV领域，设计一流的诊断、筛查和监测试剂的决心。这项计划可以使诊断检测技术能够“更上一层楼”，并给行业提供科学的领先性，保持对HIV病毒多样性的警惕，助力人类早日战胜HIV病毒！
参考来源：
1. https://news.un.org/zh/story/2020/07/1061391
2. Gupta, R. K., Peppa, D., Hill, A. L., Galvez, C., Salgado, M., Pace, M., et al. (2020). Evidence for HIV-1 cure after CCR5Δ32/Δ32 allogeneic haemopoietic stem-cell transplantation 30 months post analytical treatment interruption: a case report. Lancet HIV. 7, e340–347. doi: 10.1016/S2352-3018(20)30069-2
3. Kramer L. A tribute to Mathilde Krim, Ph.D. Founding Co-chair of amFAR. The Foundation for AIDS Research. Thank you, Dr. Krim. AIDS Patient Care STDS. 2006;20(7):453-455. doi:10.1089/apc.2006.20.453
4. 强来英,HIV 抗体诊断试剂的发展． 中国健康教育,2006,22( 11) : 863-865
5. Li L,Li KY,Yan K,et al． The history and challenges of blood donorscreening in China． Transfusion Medicine Ｒeviews,2017,31 (2) : 89-93
6. https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/approved-blood-products/abbott-architect-hiv-agab-combo
7. https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/approved-blood-products/bioplex-2200-hiv-ag-ab-assay
8. https://www.mlo-online.com/home/article/13008643/a-fifth-generation-hiv-assay
9. Alexander TS. 2016. Human immunodeficiency virus diagnostic testing: 30 years of evolution. Clin Vaccine Immunol 23:249 –253. doi:10.1128/CVI.00053-16.
10. 三种不同技术原理的第4代HIV诊断试剂的临床检测性能比较研究. 中华检验医学杂志. 2013年10月第36卷第10期 . 欧阳金鸣/尚红等
11. 全国艾滋病检测技术规范. 2020年修订版.
12. https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html
13. Complete genome sequence of CG-0018a-01 establishes HIV-1 subtype L, Yamaguchi, Julie BS; McArthur, Carole MD; Vallari, Ana MS; Sthreshley, Larry PhD; Cloherty, Gavin A. PhD; Berg, Michael G. PhD; Rodgers, Mary A. PhD,