柠檬酸含量检测试剂盒（Cr（Ⅵ）还原法）

　　【Boxbio】柠檬酸含量检测试剂盒（货号：AKAC003）

　　柠檬酸（CA）作为三羧酸循环第一步反应产物可参与光合作用、呼吸作用以及氨基酸、芳香物质、酯类和酚类物质的合成过程，其含量对于分析代谢过程具有重要意义，柠檬酸及其盐独特的分子结构使其具有各种优良的性质，可作为风味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗血凝剂、缓蚀剂等，在食品加工、化妆品、畜牧业和医药领域具有广泛应用。

　　柠檬酸能够在酸性条件下将Cr6+还原为Cr3+，并生成柠檬酸铬螯合物，产物在545 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值的变化即可定量检测柠檬酸的含量。

　　柠檬酸检测原理

　　测定过程中所需要的仪器和试剂：可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。

　　1.柠檬酸的提取（可根据预实验结果适当调整样本量及比例）

　　①液体样本：取0.1 mL液体样本加入0.9 mL试剂一充分混匀，4℃ 11000 g离心10 min，取上清液置于冰上待测。

　　②组织样本：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：（5-10）的比例（建议称取0.1 g组织，加入1 mL试剂一）处理样品，冰浴匀浆，4℃ 11000 g离心10 min，取上清液置于冰上待测。

　　③线粒体中柠檬酸的提取：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：（5-10）的比例（建议称取0.1 g组织，加入1 mL试剂一）处理样品，冰浴匀浆，4℃ 600 g离心5 min；取上清至新的离心管中，4℃ 11000 g离心10 min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加入200 μL试剂二和2 μL试剂三，充分悬浮溶解，4℃ 11000 g离心10 min，取上清液置于冰上待测。

　　④细菌、真菌中柠檬酸的提取：离心收集细菌或细胞到离心管内，按照细菌或细胞数量（10个）：试剂一体积（mL）为（500-1000）：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1 mL试剂一）处理样品，冰浴超声破碎细菌或细胞（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min），4℃ 11000 g离心10 min，取上清液置于冰上待测。

　　吸光值测定：将反应液置于1 mL玻璃比色皿中，测定545 nm处吸光值，记为A测定，A标准和A空白，计算A测定=A测定-A空白，A标准=A标准-A空白。注：空白管只需测定1-2次。

　　标准曲线的建立：以4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mmol/L为横坐标（x），以其对应的A标准为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将A测定带入公式中得到x（mmol/L）。

　　注意事项

　　①样本和待测样本均需置于冰上放置，柠檬酸提取过程需在冰上进行；

　　②若测定吸光值超出标准线性吸光值范围：大于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定；小于最低值建议适当增加样本量重新提取后再进行测定，计算时相应修改；

　　③试剂五为易致癌物质，实验过程中需佩戴手套并做好防护，避免皮肤接触；

　　④柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，应另取组织进行测定；

　　⑤若显色30 min后出现明显黑色颗粒，属于正常现象，需将待测样本适当稀释后重新进行测定；

　　⑥为保证结果准确且避免试剂损失，测定前请仔细阅读说明书（以实际收到说明书内容为准），确认试剂储存和准备是否充分，操作步骤是否清楚，且务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定，过程中问题请您及时与工作人员联系。

　　For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

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