求臻医学：ctDNA可提早预测RAS野生型mCRC一线含EGFR单抗治疗疗效
臻知识·专家访谈 | 第32期
接受抗EGFR单抗治疗的患者大多不可避免地会出现获得性耐药，在耐药机制探索方面独具优势的液体活检技术在晚期结直肠癌（mCRC）一线治疗中是否可以用于预测早期治疗应答值得研究。求臻医学特邀中国医科大学附属盛京医院肿瘤内科王赫教授，结合近期发表在Clin Cancer Res杂志上的文章进行解读。
王赫教授：抗表皮生长因子受体（抗EGFR）单克隆抗体联合化疗是RAS野生型mCRC患者的一线标准治疗，但接受抗EGFR单抗治疗的患者大多不可避免地会出现获得性耐药。提前发现耐药机制有利于临床医生对患者病情做出准确评估并及时调整治疗策略，为患者争取最佳预后。液体活检在耐药机制探索方面具有独特优势，近年来积累的临床证据越来越多，但在mCRC一线治疗中是否可以用于预测早期治疗应答还有待研究。
近期在Clin Cancer Res杂志上发表了一篇相关文章，试图解答以上疑问，文章基于PLATFORM-B研究，共入组100例RAS野生型并接受一线化疗联合西妥昔单抗治疗的mCRC患者，分别于基线、第三周期治疗前（C3）采集血液样本进行ctDNA-NGS检测。72%的患者基线ctDNA阳性，34%的患者C3 ctDNA阳性，ctDNA主干突变丰度降低与PFS延长相关（HR=0.23，P=0.001），C3时的耐药突变均为RAS/RAF突变，C3时RAS/RAF相对突变丰度增加与疾病进展相关，PFS显著缩短（HR=10.5，P<0.001）。C3时联合主干突变和耐药突变是预测早期应答的最佳预测因子，早期分子应答患者的ORR更高（77.5% vs. 25% P=0.008），PFS更长（HR=0.18，P<0.001）。ctDNA提示的早期分子应答患者PFS及ORR均较早期分子进展患者显著改善。
值得注意的是，本研究中在治疗2周期后发现15%的患者为早期分子进展患者，而影像学评估则在C6时才确认疾病进展。因此，早期识别快速进展患者可有效避免过度治疗，减少治疗带来的毒副作用并指导下一步治疗方案。
综上，本研究是首个评估早期液体活检在RAS野生型mCRC患者一线治疗中临床作用的前瞻性研究，研究结果证实利用治疗早期的ctDNA动态变化可预测治疗疗效，但需同时关注主干突变和耐药突变的相对突变丰度，低频耐药突变并不一定代表对于治疗无应答，需关注亚克隆对于整个疾病负担的影响。随着检测技术的提高，ctDNA已逐渐克服在早期肿瘤临床应用的局限，良好的敏感性对于肿瘤复发转移的预测越来越精准，建议利用NGS检测对肿瘤进化进行全面评估，与影像学检查互为补充，指导早期治疗决策。
摘要
化疗联合EGFR单抗是RAS野生型mCRC的标准一线治疗，但缺乏预测临床早期应答的标志物。本研究旨在确定ctDNA在预测接受一线抗EGFR单抗治疗的mCRC患者早期应答中的作用。共入组100例患者，分别在基线时及C3（第三周期治疗前）时取血液样本进行NGS检测，72%的患者基线ctDNA阳性，34%的患者C3 ctDNA阳性。ctDNA主干突变丰度降低与PFS延长相关（HR=0.23，P=0.001）。C3时的耐药突变均为RAS/RAF突变，C3时RAS/RAF突变丰度增加与疾病进展相关，PFS显著缩短（HR=10.5， P<0.001）。C3时联合主干突变和耐药突变是预测早期应答的最佳预测因子，早期分子应答患者的ORR更高（77.5% vs. 25% P=0.008），PFS更长（HR=0.18，P<0.001）。ctDNA检测早期分子应答可预测化疗联合西妥昔单抗治疗疗效，建议利用NGS方法，整合疾病负担及耐药突变去做分析。
研究背景
抗表皮生长因子受体（抗EGFR）单克隆抗体联合化疗是RAS野生型mCRC患者的一线标准治疗，但接受抗EGFR单抗治疗的患者大多不可避免地会出现获得性耐药。循环肿瘤DNA (ctDNA)携带肿瘤特异性突变，在mCRC诊疗中的临床价值证据不断积累。基线血液样本和肿瘤组织样本检测RAS突变具有良好的一致性，可用于指导一线治疗。然而，ctDNA中RAS突变的VAF（等位基因突变频率）能否预测抗EGFR单抗治疗疗效以及最佳检测方法仍值得商榷。本研究假设ctDNA可预测化疗联合抗EGFR治疗的早期应答，同时可跟踪肿瘤克隆进化，鉴别早期耐药。
研究方法
本研究（PLATFORM-B研究）为前瞻性、多中心、观察性研究，纳入接受一线化疗联合西妥昔单抗治疗的RAS野生型mCRC患者。分别于基线、第三周期治疗前（C3）采集血样行ctDNA检测（图1A）。VAF为某位点的突变reads数/该位点所有reads数。主干突变为血浆样本中VAF值最高的体细胞突变，其他相关突变的VAF（rVAF）也会被计算。RAS、EGFR-ECD、BRAF及MAP2K1突变为抗EGFR单抗治疗的耐药突变。
研究结果
2017年至2018年共入组100例患者。入组流程见图1B。患者临床病理学特征见表1。中位随访时间为25个月。11%患者达到CR，54%达到PR，15%为SD。临床获益率（CBR，CBR=CR+PR+SD≥16周）为83%。中位PFS为15.1个月，中位OS为27.3个月（表1）。
表1. 患者基线临床病理学特征及临床结局
与基线ctDNA检出相关的唯一临床病理因素是原发肿瘤是否切除（P=0.007）。分别在基线时及C3时采集血样并进行NGS检测，其中RAS突变同时用dPCR和NGS两种方法进行检测（图1A）。利用包含14个mCRC热点基因的NGS panel进行ctDNA测序，分别有72.3%基线血浆样本、33.8% C3血浆样本中检测到至少一种体细胞突变(图2A、B)。
图1. 研究设计及流程
基线RAS/BRAF ctDNA及耐药
NGS及dPCR检测基线ctDNA中的RAS突变率分别为8.4%、11.5%。dPCR检测中位VAF值为0.02%，NGS未检测到，因为dPCR检测的灵敏度高于NGS。针对组织和血液样本RAS突变状态不一致的病例进行中心实验室复核，其中5例组织复核阳性，5例患者真实存在血浆-组织检测结果不一致，均存在肝转移，其中1例患者基线存在BRAF突变（VAF 4.35%）。研究试图定义可预测抗EGFR单抗耐药的RAS/BRAF突变最佳VAF值，尽管以VAF 1%为cut-off值能够区分PFS，但无统计学差异（16.0 vs 7.0 months, HR=0.753; 95% CI 0.47-1.2; P=0.230）。
主干突变的早期变化可预测治疗早期应答
基线最常见主干突变为TP53（41.7%）及APC（28.3%），C3时最常见主干突变为TP53（45.8%）（图2C）。主干突变的中位VAF值由基线时25.0%降至C3时1.0%。基线ctDNA主干突变不能预测预后及疗效（图2D）。相反，C3时ctDNA中的主干突变可预测化疗联合西妥昔单抗的应答（ctDNA阴性对比ctDNA阳性患者：CBR 95.7% vs 79.2%, P=0.04）。二者的动态变化亦可预测临床获益：获益患者ctDNA中主干突变中位VAF值降低81.5%，进展患者ctDNA中主干突变中位VAF值升高31.9%。ctDNA中主干突变VAF值降低与PFS延长显著相关（18 vs 4个月，HR=0.23,P=0.001）,OS亦有延长趋势，但无统计学差异。
图2. 基线（A）及C3（B）ctDNA NGS检测出的基因突变 C.基线及C3的ctDNA主要突变 D.经RECIST 1.1评估的疗效
耐药突变的早期出现可预测治疗无应答
为了研究抗EGFR单抗治疗期间RAS和BRAF突变的克隆演化，本研究分析了RAS/BRAF突变相对于主干突变的等位基因频率（rVAF）。C3时4例患者RAS/BRAF突变rVAF升高（图3A），其余5例患者下降或无变化（图3B）。C3时与耐药相关的RAS/BRAF突变rVAF增加可预测与疾病进展相关的克隆性扩增。相反，C3时RAS/BRAF突变rVAF降低的5名患者中，不一定出现RAS亚克隆扩增，并发现其他晚期获得性耐药机制（主要为EGFR-ECD)，VAF值较低，表明存在亚克隆性（图3A）。
图3. A. C3时RAS/BRAF rVAF值降低的患者应答较好；B. C3时RAS/BRAF rVAF值升高的患者出现快速进展
主干突变及耐药突变的早期变化可预测疗
将患者分为早期分子应答组（C3时ctDNA中主干突变和RAS/BRAF突变频率降低）及早期分子进展组（C3时ctDNA中主干突变和/或RAS/BRAF突变频率升高），前者ORR及CBR均较后者显著升高（ORR：77.5% vs. 25% P=0.008 ；CBR：92.5% vs 62.5%; P=0.061 ；图4A），PFS显著延长（HR=0.18；95% CI 0.078–0.42；P<0.001；图4B），但OS并无统计学差异。考虑到CRC抗EGFR单抗治疗对于发病部位有偏好性，将原发肿瘤位置纳入多因素分析，经校正后，早期分子应答仍然是预测疗效的显著预测因子（HR=0.16；95% CI 0.070–0.388；P<0.001）。
图4. A. 早期应答患者/早期进展患者经RECICT 1.1标准评估的ORR；B. 两组患者的PFS比较
讨论
PLATFORM-B研究是首个评估早期液体活检在RAS野生型mCRC患者一线治疗（化疗联合西妥昔单抗）中临床作用的前瞻性研究。通过NGS分析基因突变状态，证实ctDNA中主干突变及耐药突变的早期改变可较传统影像学标准更早预测治疗应答及临床获益。ctDNA早期分子应答患者PFS及ORR均较早期分子进展患者显著改善。
RAS野生型mCRC患者一线治疗中，有15%患者出现快速进展。本研究中在治疗2周期后发现15%的患者为早期分子进展患者，而影像学评估则在C6时才确认疾病进展。因此，早期识别快速进展患者可有效避免过度治疗，减少治疗带来的毒副作用并指导下一步治疗方案。
本研究提示C3时RAS/BRAF突变克隆的出现具有不同的临床意义。C3时RAS/BRAF rVAF值增加的患者，会在治疗过程中持续扩增直至疾病进展，与PFS缩短相关；RAS/BRAF rVAF值未增加患者，RAS/BRAF亚克隆在治疗期间无扩增，也不是出现PD的主克隆，但是可能会出现其他耐药亚克隆（如EGFR-ECD突变），PFS较前者相对延长。早期耐药突变均为RAS/BRAF突变，EGFR-ECD突变出现较晚。
大多数研究用dPCR方法去跟踪ctDNA中组织已检测到的突变，本研究不考虑组织样本的突变情况，利用NGS方法检测CRC常见突变，可对多个基因的多个突变进行分析，临床实用性更强。整合主干突变及耐药突变，增加治疗期间ctDNA检测概率，可对肿瘤动态变化及克隆进化进行综合评估。研究发现任何主干突变ctDNA百分比降低较特定cut-off值更能预测疗效。cut-off值受多种因素影响，而ctDNA改变百分比则是每例患者及肿瘤所固有的。因此，治疗期间患者ctDNA的相对变化可能更加准确易行。
参考文献：
Liquid biopsy detects early molecular response and predicts benefit to first-line chemotherapy plus cetuximab in metastatic colorectal cancer: PLATFORM-B study.
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