百人多次检测才转阳，肛拭子真能解决问题吗？ 病毒突变致核酸检测失灵才是原因
核心提要
1. 新冠病毒突变导致部分核酸检测试剂盒失效，国内外多地出现“多次检测阴性后转阳”现象。为提高病毒检出率，中国推出肛拭子检测项目，部分欧美国家近日开始效仿。
2. 肛拭子检测并不一定比鼻咽拭子更为灵敏，尤其可能不适用于筛查早期感染者。其原因可能是，病毒聚集的部位随着病毒感染进程的变化而发生改变。
3. 在粪便和肛拭子之间，粪便检测其实是优先选项，但相比粪便标本，肛拭子采集具有不易造假的优点。
4. 针对病毒突变可能给核酸检测带来的影响，有关部门应加强对检测试剂盒生产者的监督，及时推出适合病毒变异体的试剂盒，同时增加三靶标的试剂盒，以及对已经隔离14天的人员进行IgM检测而非肛拭子检测。
日前，网传“石家庄市民进过肛拭子核酸检测后秒变企鹅，走路姿势变成了外八字”。相关的视频随即被披露是谣言，但是国内确实对一些重点隔离的人群开始进行肛拭子检测。
病毒突变致多种核酸检测试剂失效，肛拭子检测新冠病毒继国内推广使用后，似乎正在成为国际通用做法。2月1日，西班牙也开始在加西亚省将肛筛用于检测新冠肺炎。而相关资讯表明，欧美有部分医院在对部分重症病人的相关测试中，增加了粪便检测。而南非、英国出现了新的病毒突变体后，
美国FDA日前警示，认为病毒突变已经致部分试剂失灵，并列举了几个可能会受到突变影响的试剂盒。肛拭子真能解决灵敏度不够的问题吗？到底应该如何应对？有没有比肛拭子更好的办法？
隔离中密切接触者多次检测阴性后转阳，核酸检测灵敏度有问题新冠确诊病例在全球已经突破1亿人。在中国，疫情在入冬之后也有死灰复燃的情况，为了保障春运、春节的安全，很多地方加大了病毒检测的力度，而肛拭子检测，是如今在一些地方新增加的检测项目。
图/国外发布的关于自己采集肛拭子标本的示意图
肛拭子检测核酸，是否比咽拭子更灵敏？患者出院的双检测可能较合理，早期感染的筛查，是否有效，值得商榷肛拭子检测新冠病毒，并不是2021年的新事物。去年5月13日发表的一份综述性研究，专门整理了肛拭子及粪便中进行的新冠病毒核酸检测结果，总共找到12份已经发表的研究，全都来自中国。在这12个研究里，总共有324个新冠患者，其中107名患者在鼻咽拭子样本核酸转阴之后，肛拭子或粪便检测仍然显示阳性，持续时间为5 －35天 (1)。鼻咽拭子都转阴了，肛拭子还阳性，这似乎可以理解为肛拭子检测更灵敏。但是事情并没有那么简单，因为对患者同时进行的检测发现，也有这样一些患者，鼻咽拭子结果是阳性的，但肛拭子或粪便的结果却是阴性 (2, 3)。有一种说法认为，随着病毒的感染进程变化，病毒富集的部位会有不同，一开始主要是在鼻咽、呼吸道，最后会迁移到肠道、肛门。如果这个说法是对的，那么肛拭子和粪便的检测，对于决定患者是否完全转阴、是否能出院，是比较合理的，至少可以把它当作一个双保险，如果患者鼻咽拭子、肛拭子都是阴性了，那说明体内病毒清除得比较彻底，可以放心出院了，也不用担心排毒感染其他人。但是用来作为早期感染的筛查，就不太合适了。
图/深圳华大基因试剂盒。核酸试剂在国内已成为一个较大的产业，据不完全统计，目前共有上百种核酸试剂盒，产值已在数百亿。
如果非要检测肛拭子或粪便，是否非要采菊？肛拭子不易作假，如果用粪便检测，会出现作假可能根据中国疾控中心网站上公布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》，对于粪便标本/肛拭子的表述是：“留取粪便标本约10克（花生大小），如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。”可见，粪便标本是优先考虑的，只有在没有粪便标本的情况下，才进行肛拭子采集。已有研究表明粪便中可以培养出活的病毒(2)，但是并没有证据表明肛拭子比粪便更容易检出病毒。在之前进行肛拭子检测的研究中，很多患者是儿童，有的还不到1岁。想让这些患者提供粪便，似乎不太容易，不如直接用棉花签采菊，获得肛拭子样本。可是现在进行肛拭子检测的，大部分都是成人，为什么不能采集粪便，必须要使用伤害性不大，但羞辱性极强的肛拭子呢？在没有看到官方的解释解释之前，这里只能提供一个猜测：肛拭子不容易作假！如果让被检测者提供粪便，他们会不会随便借个粪便来蒙混过关呢？如果检测肛拭子，需要人员亲自将棉花签插入肛门，从保证样品的真实性来说，总比亲自监督被检测者提供粪便更容易。之所以想到这个原因，是看到某个提供核酸检测的地方，说可以在鼻咽拭子取样时同时拍照，作为申请绿码的证据。如果疫情更严重了，也许以后申请绿码需要肛拭子取样，不知道会不会需要拍照为证呢？
核酸检测“多次阴性”失效，真正原因可能是病毒突变了
从上面的分析其实可以看出，肛拭子检测并不见得比鼻咽拭子更灵敏，尤其可能根本不适用于尚只是处于早期的感染者。更关键的是，如果病毒出现了突变，原有的检测方法会受到影响，如果不改变方法，只是加大检测力度，很难获得理想的效果。大家可能听说了，病毒突变之后，可能会对疫苗的效果产生影响。目前已经有数据表明，南非变异体能让一些疫苗的保护率有所降低。那么，病毒突变导致检测失败的可能性存在吗？肯定的！这已经有先例了。英国出现病毒变异株B1.1.7， 在病毒的S基因处有数个突变，而S基因也是目前很多核酸检测所针对的区域。对此，世界卫生组织就已经发出公告警示，表明B1.1.7变异株S基因69/70位置的缺失突变，会影响现有的核酸检测。
美国FDA也对此做出了警示。在FDA的“温馨提示”信件中，还具体列举了几个可能会受到突变影响的试剂盒：做核酸检测的美国公司Helix也注意到了病毒突变对检测的影响(4)。该公司的核酸检测同时测3个新冠病毒的基因：ORF1ab, N，和 S基因，因为英国出现的B.1.1.7.毒株在S基因上有缺失突变，检测中能检出ORF1ab和N，但是检不出S基因(4)。这个现象，叫做“S基因退群”。正是因为有这个“S基因退群”现象，目前类似Helix公司的核酸检测，也可以初步用来判断样本中的病毒是否是B.1.1.7.毒株。
图/上海一家生物企业生产的试剂盒
图/上海一家PCR实验室中的PCR检测仪
因为病毒突变，导致河北的检测多次出现阴性的可能性有多大？
根据第一财经的调查报告，在前面提到的石家庄市病例15的检测过程中，在1月18日以前，核酸检测结果都为阴性。但是，因为患者已经出现了临床症状，医院在18日使用了多种核酸诊断试剂进行检验。使用医院之前采购的某企业A核酸诊断试剂，核酸检测结果还是阴性，送到中医院进行检测，结果依然是阴性。但是如果换用S企业的核酸检测方法，结果就是阳性！1月22日，再次同时使用了A企业和S企业的两种不同检测方法，结果仍然是A企业的检测为阴性，S企业的的阳性。很显然，这两种检测结果之中，必须有一个是正确的。因为当天也进行了新冠病毒的抗体检测，结果为阳性，所以S企业的检测结果是准确的。在核酸检测中，对于每一个靶标，需要有两个引物序列和一个探针序列。如果病毒在这些引物或者探针的序列处发生突变，就会影响检测的效率。在中国疾控中心发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中（下面简称《技术指南》），新冠病毒核酸检测的两个靶标分别为ORF1ab 基因和N基因。目前在河北流行的病毒株，会不会正好在这些关键的部位出现突变呢？1月6日，《中国疾病控制预防中心周报》公布了石家庄和邢台两例新冠病毒感染的病毒基因测序分析结果 (5)。根据所公布结果，这次河北藁城流行的毒株，与近期国内其它地方疫情中发现的毒株不同，与去年7月份在俄罗斯报道的毒株同源，属于B.1.1.123毒株。很巧的是，这种毒株的病毒基因上第28881～28883位碱基处正好发生了突变，而这里正好是N基因的正向引物的位置！
一般来说，如果引物与病毒的序列不能完全匹配，会大大影响扩增的效率，也就会影响检测的灵敏度。而要解决这样的问题，换粪便、肛咽拭子都没大用，需要重新设计引物，或者使用其他不受影响的检测试剂盒。
是否A企业的双靶标试剂盒使用的引物正好与《技术指南》相符，导致检测结果受到基因突变影响？而S企业的试剂盒正好完美地躲过了这个突变？这需要有关方面来揭开谜底。
图/成都一家公司的核酸检测试剂盒
面对病毒，我们不能只是“脱裤子”，还得动脑子针对病毒突变可能给核酸检测带来的影响，为了更加有效地检出病毒，在此谨提出几条建议，供有关部门参考。1. 所有生产核酸检测试剂盒的公司，应该及时提供信息，表明试剂盒的检测结果是否会受目前已经出现的病毒影响。
厂家不需要获得病毒株，可以根据网上公布的病毒突变序列，就可以设计病毒的核酸模版来来验证。2. 为了避免假阳性和假阴性，可以增加三靶标的检测试剂盒。
在《技术指南》第二版中，确实提到需要“同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性”，才能确认一个病例为阳性。这样要求，是为了减少假阳性，但是却会增加假阴性。在后来的《技术指南》版本中，已经对此修改，如果重新采样，重新检测后仍为单靶标阳性，则可判定为阳性。
图/目前《技术指南》判断阳性病例的标准
如果在隔离前已经感染病毒，那么这时候应该有IgM阳性结果。常听到这样的感叹：新冠病毒太狡猾！
面对着狡猾的病毒，如果我们不能多动脑子，那底裤真会被输掉。参考文献：1.Kipkorir V, Cheruiyot I, Ngure B, Misiani M, Munguti J. Prolonged SARS‐Cov‐2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID‐19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT‐PCR test. Journal of medical virology. 2020;92(11):2328-31.
2.Wang W, Xu Y, Gao R, Lu R, Han K, Wu G, Tan W. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020;323(18):1843-4. doi: 10.1001/jama.2020.3786.
3.汪小五, 朱义朗, 李团团, 高勇. 新型冠状病毒肺炎患者恢复期肛拭子中 SARS-CoV-2 核酸检测结果评价. 天津医药. 2020;48(7):592.
4.Washington NL, White S, Barrett KMS, Cirulli ET, Bolze A, Lu JT. S gene dropout patterns in SARS-CoV-2 tests suggest spread of the H69del/V70del mutation in the US. medRxiv. 2020:2020.12.24.20248814. doi: 10.1101/2020.12.24.20248814.
5.Qi，Shunxiang, Zhao X, Hao P, Liu N, Gao GF, Song Y, Xu W, Li Q. Two Reemergent Cases of COVID-19 — Hebei Province, China, January 2, 2021. China CDC Wkly. 2021.
6. SARS-CoV-2 Variant – United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland, Disease Outbreak News, 21 December 2020, https://www.who.int/csr/don/21-december-2020-sars-cov2-variant-united-kingdom/en/.
7. Genetic Variants of SARS-CoV-2 May Lead to False Negative Results with Molecular Tests for Detection of SARS-CoV-2 - Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers. https://www.fda.gov/medical-devices/letters-health-care-providers/genetic-variants-sars-cov-2-may-lead-false-negative-results-molecular-tests-detection-sars-cov-2.