核酸检测假阳性？令人哭笑不得的原因

　　作者丨刘强

　　单位丨怀化市肿瘤医院

　　前言

　　随着新冠疫情的持续，目前全国各大中小型医院大多已具备核酸检测能力。核酸检测作为新冠确诊的金标准，却具有奇高的假阴性率，对于“假阴性”这里不做过多阐述，可参阅《》。那么目前面对大批量样本的临床检测，作为核酸检测人员，你能确定你做出的“阳性”就一定不是“假阳性”吗?

　　案例经过

　　2020年7月2号，我院第一次正式开展新型冠状病毒核酸检测工作。在此之前本科室先后抽调3名工作人员前往其他单位协助进行核酸检测工作，工作流程及操作方面已准备充分。我很荣幸参与到这项工作中，成为科室的“先头兵”。收集样本、核对名单、样本编号、试剂配制、实验操作、上机扩增、实验室消毒，一切按照我所预期的剧本进行着，期待着所有样本呈阴性，然后发报告、顺利下班。

　　可当结果出来以后，却发现我拿的剧本好像出了点问题，“小插曲”出现了。见下图：

　　第一批次20号样本

　　

　　—阈值，—FAM通道，—VIC通道，—ROX通道

　　图1

　　FAM通道ct值为14.98，代表新冠ORF-1ab基因

　　VIC通道ct值为17.04，代表新冠N基因

　　ROX通道ct值为28.05，代表管家基因

　　我们采用的试剂为上海伯杰新冠核酸检测试剂，其说明书给出的阳性参考值为ct≤38。

　　仅从ct值方面判断，该样本新型冠状病毒核酸检测为阳性。

　　

　　

　　图2 图3

　　阴阳性对照曲线见下图：

　　

　　图4 阳性对照

　　

　　图5 阴性对照

　　阴阳性对照结果无异常，那么20号样本新冠核酸检测结果是“真阳性”吗？

　　案例分析

　　本批次共检测90个样本，除20号样本外，还有其他7个样本的曲线也出现尾部抬高现象，如1号和4号样本，见下图：

　　

　　

　　图6 1号样本 图7 4号样本

　　其他样本曲线正常，如6号样本，见下图：

　　图8 6号样本

　　这8个样本为何会出现这种异常曲线？这些样本的检测结果是“真阳性”还是“假阳性”？有没有可能是仪器出现故障？或是操作过程被阳性对照污染？一连串问号在我脑子里疯狂快速地打着转。带着这些疑问，我查看了各样本的原始曲线（上图中的曲线是经过处理的相对曲线）

　　1、 正常样本的原始曲线图

　　图8

　　从上图8可见，FAM通道和VIC通道基本为一条直线，ROX通道基线期、指数增长期和平台期分隔明显，符合标准的S型曲线。

　　2、异常样本原始曲线图

　　

　　

　　图9 20号样本 图10 1号样本

　　这两个样本的曲线有个共同点，它们的FAM和VIC通道曲线不符合标准S型曲线，基线期、指数增长期、平台期无明显分隔。其它异常样本曲线同上。从这个曲线图来看，我开始怀疑这些异常样本ct值的真实性了。于是把所有异常样本找出，和第二批样本一起进行复查。

　　复查结果出来了，可结果却让我更加疑惑了。

　　复查的20号样本结果变为标准阴性，可第二批样本中出现了更多和之前一样的异常曲线，总共检测96个样本，出现了12个异常曲线，曲线特点和第一批一样，如下图：

　　

　　

　　图11 第二批12号相对曲线 图12 第二批12号原始曲线

　　

　　

　　图13 第二批16号相对曲线 图14 第二批16号原始曲线

　　出现第二次异常曲线后，我静下心来整理思绪，开始分析原因：

　　1、 试剂配制过程

　　试剂配制完全按照操作流程规范操作，无原则性错误。

　　2、 核酸提取过程

　　样本经56℃灭火30min后进行核酸提取，吸样操作规范，核酸提取在全自动核酸提取仪中进行，减少了人为操作误差。

　　3、 扩增仪存在故障？

　　扩增仪在正式投入使用之前做了两次测试及性能验证，但考虑到并没有测试所有孔位，马上怀疑是否个别孔位温控系统或者读取荧光系统存在缺陷。当即对照了第一批和第二批出现异常曲线的孔位，第一批次8个异常样本，第二批次12个异常样本，且两个批次的异常样本重复孔位少见。导致突然燃起的一丝曙光又破灭了。

　　实在找不出问题所在，只得打电话求助仪器工程师。工程师怀疑最后上机的反应管中存在气泡导致荧光读取受到干扰。由于在上机扩增前我们已经对反应管离心处理，所以对这个解释我是抱有一丝怀疑的态度的。

　　虽然有点怀疑，但还是不自主的拿出仪器中扩增完成的反应管看了一下，也许经过高温扩增以后还能看到几个大气泡也说不定。事实证明，我的第六感“怀疑”没错，气泡倒是没有看到，但我看到了真相。

　　

　　图15 扩增完成的反应管

　　图15中所标示的1、2分别是两个异常曲线样本，仔细看可以发现，这两反应管中的反应液面要低于其他管，每个反应管中加入的总体积应该是25ul，可它俩的液体量为什么会少些？遂查看其他异常样本，发现每个异常样本反应液都或多或少的减少了，而且减少的液体量越多，ct值越小。

　　真相似乎离我越来越近了，回过头再查看我们使用的八连管，却发现一个令人哭笑不得的问题：这两批样本使用的八连管与八连管盖不是同一厂家产品。我瞬间顿悟，由于实验室有其他项目采用的不同厂家试剂，而且都会配送八连管，从外型看两者没多大区别，我们在操作时使用了不同厂家的管与盖，导致个别孔位管与盖不密封，扩增途中经高温使液体蒸发。

　　从工程师处得知，该实时荧光定量PCR仪从样本顶部读取荧光值，难道是因为这些反应管不密封导致管中反应液蒸发出来，干扰顶部荧光读取?查阅资料，发现并没有相关报导，无从考证。

　　对之前的粗心大意予以纠正后进行第三次检测，结果如我所愿，不再出现之前的异常曲线，所有复查样本均为阴性。如下图

　　

　　图16 复查样本

　　在之后的检测中，类似情况再未出现，可确定本次检测为使用不配套的八连管与盖导致的假阳性结果，而其导致假阳性的具体原理还有待进一步探讨。

　　总结

　　造成PCR假阳性问题的因素相对单一, 由于PCR的敏感性和效率特别高, 只要有少的扩增产物将标本或反应管污染即可出现假阳性, PCR仪器的性能差异和温控不准等质量问题造成非特异性扩增也会导致假阳性现象。如果样本采集和PCR试剂配制及反应实验过程中, 引物设计不合理, 选择的扩增列序与非目的性扩增列序具有同源性, 检测样品出现交叉污染、PCR试剂污染或PCR扩增产物污染、气溶胶污染以及实验室中克隆质粒污染都会造成假阳性现象出现。[1]

　　除此之外在整个实验的操作过程中必须严格按照SOP执行，避免出现像我们一样的低级错误而导致实验结果假阳性。

　　参考文献

　　[1]郑甲兰.PCR检测中的假阳性和假阴性问题分析[J].中国医药指南,2012,10(22):390-391.

　　编辑：徐少卿 审校：陈雪礼