mRNA疫苗的研究现状、临床应用及市场机遇
2020年对于人们来讲是不平凡的一年，新冠肺炎疫情给全世界人类的生活和经济造成了重大的影响，而人类在抗击新冠肺炎疫情的步伐上似乎也并未滞后，新型疗法的开发和新型疫苗的研发层出不穷，自COVID-19疫情发生后，我国的科学家们分别从灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗、腺病毒载体疫苗五大技术方向推进SARS-CoV-2疫苗设计和研发，对于五大疫苗的研发，科学家们相继开展了临床前研究并启动了相应的临床试验。在不同种类的疫苗中，mRNA疫苗因其具有研发周期短（3-5年）、相对安全性、免疫应答时间长、生产周期短（40天）等优势吸引了很多研究者的目光，同时不同的制药公司也在争分夺秒地研发治疗COVID-19的新型mRNA疫苗，中国在mRNA疫苗的研发和生产上也毫不示弱；12月21日，中国首个mRNA新冠疫苗生产车间奠基仪式在云南省玉溪市高新区疫苗产业园举行，预计开工后8个月内将建成投入运营，一期产能为1.2亿剂/年。
图片来源： 2020.igem.org
一、mRNA疫苗的作用机理和发展历史
核酸疫苗是在第一代减毒/灭活疫苗和第二代亚单位疫苗基础上发展起来的第三代疫苗。目前，核酸疫苗主要分为质粒DNA疫苗和mRNA疫苗。mRNA疫苗保持了DNA疫苗能够表达胞内抗原的优点，同时克服了其免疫原性低、可能产生抗载体的非特异性免疫的缺点，且不会有整合到宿主机体DNA的风险。但mRNA疫苗的应用需要解决其稳定性较差、容易被降解的问题[1]。目前，大部分mRNA疫苗产品处于临床阶段，美国FDA于12月11日批准美国辉瑞与德国生物新技术（BioNTech）联合研发的mRNA疫苗紧急使用授权，随后一周后，美国生物技术产业的“新秀”莫德纳（Moderna）公司研发的新冠肺炎疫苗mRNA-1273的紧急使用授权申请也获得了FDA批准。因mRNA疫苗具有作为胞内抗原和生产周期短等特点，其在癌症疫苗、流感、HIV等变异性高的病毒疫苗领域具有不可代替的优势，而mRNA疫苗的开发难点在于其稳定性和递送系统，mRNA疫苗的稳定性与其分子设计息息相关。
mRNA疫苗是在体外合成含有编码特定抗原的mRNA序列，将其递送到机体内由细胞表达成抗原蛋白，诱导机体产生特异性免疫效应，进而达到免疫保护的作用。mRNA疫苗分为传统的mRNA疫苗，即非复制型mRNA疫苗（non-replicating mRNA，nrRNA）及自我复制型mRNA疫苗（SAM，self-replicating mRNA），由于主流的 SAM疫苗在传统mRNA疫苗编码抗原基因的基础上又增加了来源于甲病毒（alphavirus）编码复制酶的基因，因此这种自我复制型mRNA疫苗具备了了一定的优势[2]。
早在1990年研究者Wolff等人[3]就首次展示了mRNA的治疗潜力，但由于mRNA不稳定，容易被无处不在的RNA酶降解的缺点，被认为应用性较低，多年来mRNA疫苗及药物进展缓慢。但在2017年7月，Ugur Sahin教授带领的研究团队为每位黑色素瘤患者研发出了含有多种肿瘤新抗原的个性化mRNA疫苗，13名受试者中的8名患者肿瘤得到有效治疗且1年内没有复发，其中包括2名患者在接受疫苗后肿瘤缩小，1名患者在接受PD-1抗体药物后得到完全缓解，其他5名患者在接受疫苗时肿瘤已经出现扩散，研究结果发表在了Nature杂志上[4]，这一巨大的临床进展让全球的目光重新聚焦于mRNA疫苗上。mRNA作为肿瘤疫苗进入细胞后在细胞质中被翻译成蛋白质，成为胞内抗原并和MHC I分子结合进而提呈于细胞表面被CD8+T细胞识别后激活CTL反应，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前，mRNA疫苗受到各大研究机构和医药巨头的青睐。近两年来，mRNA疫苗技术得到了迅速发展，尤其是新冠肺炎疫苗的研发极大地推动了mRNA疫苗的发展。
二、mRNA疫苗的分子设计和递送
mRNA作为疫苗通常以线性化的DNA为模板通过体外转录获得，研究人员可以对其DNA模板和转录原料进行设计，获得分子水平精准设计的mRNA产品。其中mRNA的组成含有几个必要的元件，包括帽子结构(Cap)、5'UTR区、编码抗原蛋白的开放阅读框(ORF)、3'UTR 区和Poly(A)尾结构。通过对DNA模板上的UTR区、Poly(A)尾和体外转录时的Cap、NTP等合成mRNA的元件进行设计就能够提高mRNA的稳定性和翻译效率。除了不稳定性外，mRNA的另一个缺点是免疫原性过高，目前的策略是在mRNA分子中掺入修饰过的核苷酸，这能够显著提高其翻译效率，延长半衰期，同时还能达到降低其免疫原性的目的。mRNA疫苗需要进入细胞质，随后在细胞内被翻译成目的蛋白。因此，涉及如何把mRNA递送进入细胞的问题。在体外试验中，mRNA的递送通常采用电穿孔的方法将抗原mRNA电转进入患者自体的树突状细胞中，这已经被用于癌症免疫治疗中。目前mRNA的递送系统可大致分为两类，即脂质体纳米粒子递送系统和聚合物递送系统[1]。
图片来源： Institute for Research on Public Policy
三、mRNA疫苗的研究进展
2020年1月，一篇发表在国际杂志Science Translational Medicine上的研究报告中，来自美国宾夕法尼亚大学等机构的科学家们通过研究开发出了一种mRNA-LNP疫苗，其或有助婴儿在母体抗体的存在下产生更强的免疫反应；文章中，研究人员使用一种小鼠模型证实了，流感病毒特异性母体抗体阻止遭受流感病毒感染或接受常规流感疫苗接种的小鼠幼仔从头产生抗体反应。这种包裹在脂质纳米颗粒中的核苷修饰的mRNA（mRNA-LNP）能够部分克服了母体抗体的阻止作用。与批准用于人类的常规流感疫苗相比，这种mRNA-LNP流感疫苗在小鼠幼仔中建立了长寿的生发中心，并引发了更强的抗体反应[5]。2020年7月一项刊登在国际杂志NEJM上的研究报告中，来自美国的研究人员发表了他们的中期研究结果，即一种旨在预防COVID-19在研疫苗mRNA-1273在健康成年人中具有良好的耐受性，其能产生高滴度的中和性抗体。这种实验性疫苗是由NIAID和马萨诸塞州剑桥市Moderna公司的研究人员共同开发的[6]。同一个月，来自北京大学等机构的科学家们在Cell杂志上刊文表示，他们开发出了一款新型的mRNA新冠疫苗，其在小鼠和非人灵长类动物模型中能够激发宿主产生免疫反应，并诱导产生中和抗体。值得一提的是，这款新型疫苗采用了先进的制剂技术，在室温下能够存放至少一周而依旧保持稳定；对于疫苗产品而言，有望大大减少运输时的冷链要求[7]。
2020年8月，发表在Nature杂志上的一篇研究报告中，来自NIH和生物技术公司Moderna合作开发的首个在美国第一个进入人体试验的实验性mRNA疫苗—mRNA-1273在经过精心改造的刺突蛋白的帮助下，已被证实能引起中和抗体和有益的T细胞反应[8]。同一个月，刊登在Nature杂志上的另一篇研究报告中，来自辉瑞公司的研究人员报道，一种基于前沿RNA基因技术的候选疫苗在一项早期临床试验中表现出强效抵抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的迹象。这种称为BNT162b1的候选mRNA疫苗在参与者中引发了强烈的免疫反应，而且这种免疫反应随着剂量水平的增加而增加，此外注射第二剂也会增加这种免疫反应[9]。随后10月一篇刊登在NEJM杂志上的研究报告中，研究人员公布了实验性新冠疫苗mRNA-1273的后期研究进展，研究人员发现，这种实验性疫苗在老年群体中具有良好的耐受性。尽管一些志愿者在接种疫苗后出现了一些短暂的不良反应，但是其对这种疫苗也表现出了良好的免疫反应，接种这种疫苗的志愿者血液中含有针对SARS-CoV-2的强效结合抗体和中和抗体。重要的是，老年志愿者对这种疫苗的免疫反应与年轻群体相当[10]。
四、mRNA疫苗的应用
mRNA疫苗在肿瘤防治领域的应用
到目前为止，大多数mRNA疫苗的应用都集中在癌症研究领域，肿瘤mRNA被用来帮助宿主的免疫系统识别并对特定肿瘤产生的蛋白质做出反应，这项技术对于从事肿瘤研究的科学家们来说非常好，因为研究人员能够开发出针对不同肿瘤患者的mRNA疫苗。mRNA疫苗应用于抗肿瘤一般有2种策略，一种将mRNA传递至抗原提呈细胞即树突状细胞；另外一种是直接传递mRNA至体内。利用mRNA在研究多种肿瘤疫苗上具有多种优势特性，mRNA疫苗作为临床抗肿瘤联合用药具有非凡潜力。联合mRNA疫苗进行抗肿瘤治疗能够平衡免疫应答系统，产生强有力的抗肿瘤效果及保护对抗具有抗原的肿瘤细胞，这种mRNA诱导的抗肿瘤效果已在治疗多种肿瘤得到了证明，截止目前，mRNA疫苗已广泛应用于前列腺癌、急性骨髓白血病、转移黑色素瘤、等多种类型肿瘤的治疗研究中。
mRNA疫苗在传染病预防性疫苗研究中的应用
科学家们采用mRNA技术来研发传染病的预防性疫苗，目前已经在病毒、细菌和寄生虫等传染病方面取得了一定的进展。而且有些mRNA疫苗在临床前研究中显示出了比传统疫苗更好的免疫保护效果。目前研究人员开发出的预防性mRNA疫苗包括：流感病毒mRNA疫苗、狂犬病毒mRNA疫苗、埃博拉病毒mRNA疫苗、寨卡病毒mRNA疫苗和新型冠状病毒mRNA疫苗。
mRNA疫苗在其它疾病防治研究中的应用
研究者Weiss等人[11]使用mRNA疫苗在小鼠模型上针对Ⅰ型过敏反应的预防，能够有效阻止IgE引起的过敏性表型诱导，如过敏反应相关细胞因子的产生、嗜酸性粒细胞肺浸润等。研究者Mays等人[12]发现使用化学修饰的转录因子叉头状家族蛋白3（FOXP3）mRNA传递鼠肺用于防止哮喘，化学修饰的FOXP3 mRNA传递可以重新平衡肺部T辅助细胞反应、过敏原引起的组织炎症及其它过于强烈的呼吸道反应。
五、各大药企mRNA疫苗的研发进展和未来市场发展
2019年全球mRNA疫苗与治疗市场规模达到了125亿元，预计2026年将达到349亿元，年复合增长率(CAGR)为33.4%。预计到2032年用于传染病治疗的mRNA疫苗将占据73.15%的市场。目前，BioNTech、Moderna和CureVac并称为全球三大mRNA疗法引领者，其中，BioNTech和Moderna在此次新冠疫苗研发中均处于研发前列。
图片来源： chiangraitimes.com
Moderna一直专注于mRNA相关药物和疫苗的研发，现共有24个候选药物/疫苗，治疗领域涵盖了感染性疾病、肿瘤免疫治疗、罕见病、心血管疾病和自身免疫疾病等，12个已经进入临床阶段。新冠肺炎三期试验疫苗mRNA-1273就是该公司目前进展最快的项目。BioNTech也是全球领先的mRNA药物和疫苗研发企业，公司拥有四大技术平台，mRNA疗法平台就是其中一个，其余3个平台为细胞和基因治疗平台、蛋白质疗法平台和小分子治疗平台，目前主要关注肿瘤、罕见病和感染性疾病等领域，mRNA药物/疫苗共19个，其中7个进入临床阶段。CureVac一直专注于mRNA药物/疫苗的研发，全球首家建立符合GMP标准的RNA生产线的公司，主要关注肿瘤、感染性疾病和罕见病。目前有12个候选药物，3个进入临床阶段。
三家主要公司的 mRNA 疫苗研发管线及进展
图片来源：胡瞬，等.中国生物工程杂志，2019，39(11)：105- 112
美媒12月21日报道，美国FDA于12月11日批准了辉瑞与BioNTech联合研发的新冠mRNA疫苗紧急使用授权一周后，Moderna公司研发的新冠肺炎疫苗的紧急使用授权申请也于12月18日获得了FDA的批准。尽管均为mRNA疫苗，但两家公司开发的mRNA疫苗存在一定差异；1）从疗效的角度，BioNTech的mRNA疫苗有效率达95%，Moderna的mRNA疫苗有效率达94.1%；2）从不良反应的角度，双方均称不存在严重不良反应，但考虑到mRNA疫苗是全新的技术，未来仍须在Ⅳ期临床中进一步观察；3）从储存温度的角度，BioNTech和辉瑞的疫苗对贮存温度的要求极为苛刻，需要在-70℃的低温中存储，Moderna的mRNA疫苗在零下20℃的环境中可保存6个月，在2-8℃的普通冰箱中可保存一个月，甚至在室温环境中也可以保存12个小时，极大地增强了疫苗的普适性；4）从价格的角度，BioNTech疫苗目前定价为每剂19.5美元，较Moderna公司的疫苗每剂25~37美元的价格便宜；5）从产能的角度，BioNTech计划2021年全球供应13亿剂疫苗，而Moderna预计2021年产能达5-10亿剂。
近日披露临床试验接种剂量有出入的阿斯利康旗下新冠疫苗AZD1222已正式向监管机构递交申请，以期获得快速或附条件批准，英国药品和健康产品管理局（MHRA）已经开始滚动审评，一旦收到公司的完整安全性、有效性和质量数据，其科学家和临床医生将“随时准备对疫苗进行评估。”一旦疫苗获批，预计今年底阿斯利康将为英国准备多达400万剂疫苗，2021年3月底将累计提供4000万剂疫苗。
近日，CureVac公司宣布启动新冠疫苗3期临床试验，美因茨大学医学中心的医务工作者将于12月22日首次接种该公司研发的新冠疫苗CVnCoV；3期临床试验将评估CVnCoV疫苗以两剂12g接种的安全性和免疫原性。试验将进行随机、盲法、安慰剂对照，将有超过2500名18岁及以上受试者参与，其为最近启动的全球关键阶段2b/3试验做了补充。
尽管国内mRNA疫苗的研究落后于国外，但依然出现了一些新兴的研究mRNA的企业，包括斯微生物、艾博生物等。
小结
近年来，mRNA疫苗技术发展非常迅速，未来将会有非常广阔的发展空间。mRNA生产工艺简单、合成快速、成本较低，本身具有激活免疫反应的佐剂作用；且在细胞质中翻译不进入细胞核，不会产生整合宿主基因组的风险；同时作为核酸本身具有激活免疫反应的佐剂作用。从mRNA的本身特性、引发的免疫反应情况、大规模疫苗生产的有利条件等方面来看，mRNA疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势。迄今为止，mRNA用于治疗的目的，还限制在癌症的免疫治疗中通过将mRNA转入树突状细胞方面，目前科学家们在mRNA疫苗的研究主要聚焦于增强mRNA的稳定性、降低其免疫原性和发展新的传递技术，而将mRNA疫苗应用于不同类型疾病的防治研究也在不断的进展。
未来，mRNA疫苗技术或将借COVID-19“一战成名”，然而，在快速推进新型冠状病毒mRNA疫苗研发的同时，我们也要慎重测试和研究疫苗的安全性和有效性。随着mRNA技术研究的发展、投递介质和技术的改进及更多临床试验的研究进展，未来新的高效、稳定的mRNA传递技术将成为mRNA疫苗应用于临床的关键。总之，未来mRNA疫苗的研究将在肿瘤及感染性疾病等的防治领域发展迅猛，mRNA疫苗将会发挥更大的潜力。（生物谷Bioon.com）
参考资料：
[1] 胡瞬，易有金，胡涛，等. mRNA疫苗的开发及临床研究进展 [J]. 中国生物工程杂志，2019，39(11)：105- 112
[2] 井汇源，段二珍，董望. 体外转录的自我复制型mRNA疫苗研究进展 [J]. 中国生物工程杂志， 2020-11-17.
[3] Wolff J A，Malone?RW，Williams P，et al．Direct gene transfer into mouse muscle in vivo．Science，1990，247 (4949)：1465-1468．
[4] Sahin U，Derhovanessian E，Miller M，et al．Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly- specific therapeutic immunity against cancer. Nature，2017，547( 7662) ：222- 226．
[5] Elinor Willis，Norbert Pardi，Kaela Parkhouse，et al. Nucleoside-modified mRNA vaccination partially overcomes maternal antibody inhibition of de novo immune responses in mice. Science Translational Medicine，2020，doi：10.1126/scitranslmed.aav5701
[6] Lisa A. Jackson，M.D.，M.P.H.， Evan J. Anderson，M.D.，Nadine G. Rouphael， M.D.，et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2-Preliminary Report，New England Journal of Medicine (2020). doi：10.1056/NEJMoa2022483
[7] Yunlong Cao，Bin Su，Xianghua Guo，et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells，Cell (2020) doi：10.1016/j.cell.2020.05.025
[8] Corbett，K.S.，Edwards，D.K.，Leist， S.R. et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature 586，567–571 (2020).doi：10.1038/s41586-020-2622-0
[9] Mulligan，M.J.，Lyke， K.E.， Kitchin， N. et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature 586，589–593 (2020). doi：10.1038/s41586-020-2639-4
[10] Evan J. Anderson，M.D.，Nadine G. Rouphael，M.D.，Alicia T. Widge，M.D.，et al. Safety and Immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 Vaccine in Older Adults. New England Journal of Medicine，2020，doi：10.1056/NEJMoa2028436
[11] Weiss R，Scheiblhofer S，Roesler E，et al. Prophylactic mRNA vaccination against allergy [J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2010，10(6)： 567-574.
[12] Mays LE，Ammon Treiber S，Mothes B，et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism [J]. J Clin Invest，2013，123(3)：1216-1228.