临床研究报告｜无定形碳酸钙ACC显示出抗癌特性归因于其缓冲能力

　　研究·背景

　　肺癌是迄今为止癌症死亡的主要原因，几乎占所有癌症死亡的 25%。每年，死于肺癌的人数超过死于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的总和。开发新的安全疗法非常重要。实体瘤（例如肺癌）的主要特征之一是它们的酸性微环境。

　　尽管这已为人所知近 100 年（又名有氧糖酵解或 Warburg 效应），但它作为治疗靶点主要被忽视了。最近对肿瘤微环境酸度的了解表明其对疾病侵袭性、耐药性和耐辐射性以及患者整体预后不良的影响。

　　无定形碳酸钙 (ACC) 是一种非结晶形式的碳酸钙，由纳米尺寸的颗粒组成，具有已知的缓冲能力。这项工作描述了显示 ACC 抗癌作用与其缓冲活性相关的体内和体外结果。ACC 作为一种抗癌安全疗法具有巨大的治疗潜力。

　　本论文描述了无定形碳酸钙 (ACC) 的使用，这是一种普遍存在且高度可溶的碳酸钙形式，由纳米级颗粒组成作为两种肺癌动物模型的潜在治疗方法：Lewis 肺癌(LLC) 和具有 A549（NSCLC 人类细胞系）的异种移植模型。

　　在这两种模型中，肿瘤体积在治疗期间进行了评估，在 LLC 模型中还测量了组织蛋白酶 B 的活性水平。此外，我们想评估 ACC 对体外培养的 A549 基因表达的影响。

　　研究 · 内容

　　肺癌肿瘤微环境 (TME) 是一个复杂的微环境，具有异常血管生成、酸中毒和缺氧区域。由于细胞代谢途径从氧化磷酸化 (oxphos) 转变为糖酵解，肿瘤的微环境、炎症和缺血通常伴随着细胞外 pH 值的降低（酸中毒）。

　　这种酸中毒现象源于癌细胞经历的代谢和遗传变化（基因表达的突变或变化），即使在氧气存在的情况下，也会导致癌细胞代谢向糖酵解转变，称为 Warburg 效应或有氧糖酵解，从而导致可以产生质子（氢阳离子）和乳酸。

　　质子和乳酸通过一系列酸转运蛋白（如 MCT、NHE 和质子泵）外流，导致肿瘤微环境酸中毒 (TME)，降低细胞外 pH (pHe) 并防止癌细胞中的细胞内酸度 (pHi)。细胞外瘤周环境的酸化以多方面的方式对肿瘤有利。它对肿瘤细胞和非肿瘤细胞的作用不同，以促进肿瘤的恶性发展。

　　以下是一些示例：

　　(1) 酸性环境作用于非癌细胞信号和转录途径，导致蛋白水解酶的释放，例如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶 (MMP's)，导致肿瘤组织结构较差。此外，由于坏死或半胱天冬酶介导的 p53 依赖性细胞凋亡途径的激活和正常细胞的死亡，它会诱导正常细胞死亡。这些现象促进侵袭和转移，增加肿瘤的侵袭性 。

　　(2) TME酸度的另一个方面是它对免疫系统的影响。免疫（癌细胞的另一个标志）是一个动态过程，肿瘤通过该过程改变其免疫原性以逃避免疫反应。TME 酸度为抗肿瘤免疫反应产生了不利的环境。它降低 CD8+ T 细胞、树突状细胞 (DC)、单核细胞、自然杀伤 (NK) 细胞的功能和/或增加髓源性抑制细胞 (MDSC) 浸润或 M2 极化巨噬细胞，对 NK 和T 细胞。

　　(3) TME 酸度还与肿瘤化学抗性和放射抗性相关。甚至有人认为 TME 酸度会影响抗体的生物活性和分布，从而可能干扰包括免疫检查点抑制剂在内的治疗性抗体的临床疗效。

　　调节肿瘤酸中毒已被建议作为新疗法的潜在目标，实验模型表明，通过使用碳酸氢盐或非挥发性缓冲液 和一种名为 L-DOS47 的化合物，可以抑制转移并提高肿瘤的 pH 值，该化合物处于早期临床试验阶段，旨在提高 TME pH 值调制。

　　碳酸氢钠的临床试验未能将剂量增加到第二剂量水平以上，这主要是由于味觉不佳和 1-2 级胃肠道紊乱，导致依从性差。

　　为了评估不同的治疗是否影响肿瘤生长速率，我们比较了每个测量日每个治疗组的肿瘤体积差异。

　　对于 LLC 体内和组织蛋白酶 B，结果通过 ANOVA 进行比较，然后进行 Tukey 的多重比较测试。显着性设定为 P<0.05。

　　对于 A549 异种移植物研究，不同治疗组的肿瘤体积差异通过未配对的双尾学生 t 检验进行分析，用于确定两组之间的差异。显着性设定为 P<0.05。

　　通过将每种处理与另一种处理进行比较来分析差异基因表达，如下所示：ACC 与对照相比（A 与 B。p adj 低于 0.05 且倍数变化高于 1.1 且每个细胞计数超过 30 的结果被视为具有统计学意义。

　　研究 · 结果

　　*01

　　在这项研究中，在两种肺癌体内模型中评估了 ACC 对肿瘤生长速率的影响；LLC皮下模型和A549皮下异种移植模型。结果显示，在两种模型中，与对照（载体处理的动物）相比，ACC 对减缓肿瘤生长速率产生了显着影响（图：1、2 和 4A 和 4B）。

　　在 LLC 模型中，ACC 的效果与用化疗药物顺铂治疗的阳性对照动物的效果相似（图 1 和图 2）。

　　当顺铂和 ACC 联合使用时，发现了最深远的影响。与其他治疗相比，这种联合治疗的肿瘤生长率最低，具有统计学显着性（图 1 和图 2），可能表明存在协同效应。

　　图1

　　Figure 1. Tumor growth rates between the different groups that were administered IP with the following treatments: Saline (negative control), Cisplatin (positive control), ACC, ACC and Cisplatin, n=8, per group. Data is presented as Mean ± SEM.

　　图 1 和图 2 中的结果表明，ACC 治疗以与顺铂治疗类似的方式降低了肿瘤生长速率，在第 26 天，这两种治疗都明显优于载体治疗的动物。

　　*02

　　从第 18 天开始影响肿瘤体积（类似于 ACC 和顺铂的组合），并且顺铂的作用仅在研究的最后一天才显着（图 2）。

　　图2

　　Figure 2: This figure shows tumor mean ± SEM of each treatment during the experiment. N=8, per group, data is presented as Mean± SEM, statistical differences are represented with different letters. Each data set was analyzed for the same treatment day (p<0.05).

　　此外，ACC 和顺铂治疗的组合导致抗肿瘤作用增强，与所有其他治疗相比具有统计学显着性。

　　*03

　　来自用 ACC 和顺铂治疗的小鼠的肿瘤在实验的第 26 天被切除，与载体相比，组织蛋白酶 B 活性以统计学上显着的方式降低。

　　组织蛋白酶 B 活性在酸性环境下会增加，并且与肿瘤的侵袭性有关。

　　当检查组织蛋白酶 B 在从用载体、ACC 和顺铂处理的小鼠切除的 LLC 肿瘤中的活性时，发现与载体处理的小鼠相比，ACC 和顺铂处理的肿瘤中的活性显着降低（图 3）。

　　图3

　　Figure 3: The effect of the different treatments on Cathepsin B activity (n=8, per group). Data is presented as the mean ± SEM. Different letters represent statistical significance p<0.05.

　　我们的假设是 ACC 由于提高了肿瘤微环境的 pH 值而具有抗肿瘤作用。提高 TME 中的 pHe 与较低的转移、较低的增殖率、较低的组织蛋白酶 B 水平、增加免疫系统在肿瘤环境中的反应能力并降低化疗耐药性。

　　当 ACC 与顺铂联合使用时，肿瘤生长速度减慢的增强效果可能表明化疗耐药性降低。顺铂改变肿瘤细胞代谢并降低其糖酵解代谢，伴随着氧化磷增加。顺铂的这种代谢转变可能是图 3 中组织蛋白酶 B 活性降低的原因。

　　至于强化联合治疗；可能是通过 ACC 提高 pHe 增强了顺铂对肿瘤细胞的抗增殖作用以及代谢向氧磷的转变，从而导致致瘤性降低。

　　最近的一项研究表明，碳酸根离子对顺铂与 DNA 的结合没有影响，进一步证明 ACC 和顺铂的这种联合作用是由于碳酸根离子升高了 pHe。

　　*04

　　异种移植实验揭示了与对照相比，ACC 处理的动物在两个实验（图 4A 和 4B）中肿瘤生长速率减速的相似模式。

　　尽管对照肿瘤生长速率有一些变化，但在第二个实验中，与第11天和最终平均体积为 300mm 3 （图 4A），ACC 处理的动物在两个实验中显示出相似的肿瘤生长速率模式，达到相同的平均最终体积 150mm 3 （图 4A 和 4B），超过一半的大小控制。

　　图4

　　Figure 4: Xenograft model of A549 NSCLC human lung cancer transplanted subcutaneously into nude mice. These 2 graphs represents results of two experiments. Treatments, ACC or ve-hicle, were given daily via IP injections. Graph A n=12 per groups, and graph B n=7, per group. Data is presented as mean±SEM.

　　两次重复实验的结果显示两者的模式相似，其中 ACC 治疗装饰了肿瘤生长速率（图 4A 和 4B）。

　　虽然，在图 4B 中，对照治疗动物的生长速度更快，但 ACC 治疗导致类似的生长速度降低，最终平均肿瘤体积为 ~150mm3，而对照组的体积是对照组的两倍（图 4A 中的~300mm3 和 350mm3）在图 4B 中）。

　　*05

　　图 5(a)：描绘了火山图，每个点表示基因，其 Log2 倍数变化与 p 值的关系。浅蓝色点表示显着下调的基因。红点表示显着上调的基因。灰点表示差异表达但未超过阈值的基因。

　　图 5(b)：描绘了ACC 处理的 A549 细胞 (A549A1-A3) 与未处理的细胞 (A549B1-B3) 的聚类基因图像。每列代表一个批次，基因被过滤以仅保留差异表达的基因。

　　log 2 归一化计数被标准化为每个基因具有零均值和单位标准偏差。使用欧几里得距离度量使用 K 均值聚类对标准化日志计数进行聚类。表达谱伴随着一个颜色条，指示标准化的 log 2 归一化计数。

　　图5

　　Figure 5. A549 Lung cancer cells differential gene expression was evaluated in ACC treated cells versus non-treated cells.

　　众所周知，癌细胞会发生遗传和表观遗传变化，这些变化会导致支持其多方面癌性表型的变化。

　　在这项研究中，我们评估了 A549 细胞系（一种人类 NSCLC 系）的差异基因表达，该细胞系在培养基中有或没有 ACC 的情况下培养。结果显示基因表达模式的深刻改变（图 5A 和 5B）在本质上几乎是相反的（图 5B）。

　　*06

　　A549细胞与ACC或含CaCl的常规培养基培养的差异基因表达实验结果显示，1126个基因被上调，902个基因被完成调节，导致总共2028个基因在a中差异表达。统计方式（表1）。

　　表1

　　Table 1. Differential gene expressions in A549 lung cancer cells treated with ACC compared to non-treated cells. All of these genes were found to be statistically different (p adj<0.05).

　　图 5A 和 5B 以视觉方式说明了这些结果，火山图（图 5A）描绘了统计上调或下调的每个基因，而聚类图像显示了为每个组所做的每个三次重复中的这些变化。这些图像揭示了一种几乎相反的基因表达方式。

　　*07

　　为了理解这些结果，我们研究了已知具有致癌作用的有趣基因。表 2 总结了这些基因中的一些，这些基因显示了这些支持异种移植结果的途径的总体抗肿瘤发生作用。

　　表2

　　Table 2. A summary of some of the genes that were statistically differentially expressed in ACC treated cells compared to non-treated cells and their possible antitumorigenic role.

　　当检查一些显着上调或下调的基因及其在癌症进展中的潜在参与时（表 2），我们可以看到一般的抗肿瘤发生作用。

　　一些改变的基因已被认为是许多癌症（包括肺癌）中的治疗靶点，例如 PDL-1、ITBG2、TGFB1 和 c-JUN。

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　　虽然，我们不能直接从基因的表达推断出它们的蛋白质功能，但结合异种移植物的结果，描述的结果表明 ACC 改变癌细胞的基因表达以产生抗肿瘤发生作用，从而导致肿瘤减速。

　　ACC 是一种独特形式的碳酸钙，被美国食品和药物管理局 (FDA) 认为是安全的 (GRAS)，并且已经作为食品添加剂出售。

　　此外，在几项临床研究中，癌症患者（NCT03582280 和 NCT03057314 [58, 59]）和 COVID-19 (NCT04900337 [60]) 患者以舌下含服形式同时吸入，以试图提高其生物利用度。这些初步临床试验显示了治疗的高安全性，尤其是在 COVID-19 患者中。

　　毫无疑问，肺癌需要新的安全疗法，尤其是那些可以联合使用的疗法。ACC 在这项早期工作中显示了 2 个肺癌体内模型的深远抗癌特性，这归因于 TME 的缓冲能力（图 A1）的 pHe 调制。此外，显示 ACC 联合化疗（顺铂）增强效果的结果非常有希望探索和发展成治疗方法。

　　这项研究的主要局限性是缺乏肿瘤 pH 值变化的直接证据。这项研究结合了几个已知与 TME 酸中毒相关但尚未直接相关的证据。

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　　研究 · 结论

　　总之，我们可以看到 ACC 在两种 NSCLS 模型（LLC 和 A549 异种移植物）中降低了体内肿瘤生长率。

　　此外，ACC 降低了 LLC 肿瘤中的组织蛋白酶 B 活性，并改变了 A549 细胞系的基因表达，使其朝着抗肿瘤发生的表型发展。所有这些变化都与肿瘤的微环境酸中毒及其调节有关。

　　这些结果与ACC的高安全性相结合，为进一步支持其在肺癌患者中的临床评估提供了依据。

　　原文链接：https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03582280

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