干货分享！大分子生物分析中关键试剂的开发与制备
▎医药观澜/报道
近日，药明康德高级主任、HitS事业部抗体团队负责人王鹏博士做客药明直播间，为大家分享生物分析关键试剂的研发经验，并与大家探讨如何高效、及时开发高质量的试剂，本文将整场直播的要点及精彩内容整理成文字分享给大家。
▲王鹏博士药明康德高级主任、HitS事业部抗体团队负责人
生物分析在药物研发周期中的应用
生物分析的面向对象既包括小分子也包括大分子。小分子的生物分析主要用质谱的方法，在此不做赘述，以下重点讲讲大分子的生物分析中所用到的关键试剂。
如图1，临床前，大分子需要做PK（药代动力学）/PD（药效学）/TK（毒代动力学）以及免疫原性的分析，其中免疫原性包括抗药抗体、中和抗体的分析。众所周知，动物和人的免疫原性差别很大，那为什么在临床前的动物实验就要做免疫原性分析呢？
其原因在于临床前做动物的免疫原性分析主要目的是用来评价这个药在动物体内的免疫原性对药的代谢及药效的影响，而不是用来预测将来这个药在临床上的免疫原性。如果一个抗体在动物实验的时候就产生大量的抗体甚至中和抗体，那么极有可能导致它很快被代谢或起不到它应有的药效，这是生物分析中遇到的常见问题。做临床研究时，要对更大更多的样本做PK/PD/TK和免疫原性分析，针对特殊人群的药物还需要做伴随诊断。
▲图1：生物分析在药物研发周期中的应用
大分子生物分析的流程
做大分子生物分析首先要制备生物分析需要的关键试剂，然后再进行方法开发、方法验证和样本分析。所谓“兵马未动，粮草先行”，每个实验开始前都需要准备好这些实验的关键试剂，尤其对于一些新药，在市场上不容易找到商业化试剂，所以更需要提前规划，开始这些抗药抗体的制备。
▲图2：大分子生物分析的流程
大分子生物分析所需要的试剂
ADA（抗药性抗体）实验，通常使用多克隆抗体。而PK（药代动力学）实验一般尽可能用单克隆抗体。其他例如Nab（中和抗体）和Biomarker（生物标记物）分析，CDx（伴随诊断）大多也是用单克隆抗体来做，但应用于CDx的试剂因为有临床试验的需求，其试剂要求和相关法规会与其他分析不同。单克隆抗体制备常规情况下需要100天，CDx因为需要做大量的实验验证，时间会在200天左右。
▲图3. 大分子生物分析所需要的试剂
不同大分子做ADA（抗药性抗体）和PK（药代动力学）分析所需要的试剂
图4总结了一些主要生物药做ADA（抗药性抗体）和PK（药代动力学）分析所需要的抗体试剂。这些生物药大概可分为多肽、重组蛋白、Fc融合蛋白、单克隆抗体、双特异性抗体和多特异性抗体、ADC（抗体药物偶联物）以及基因治疗和细胞治疗几个类型。
ADA实验需要用一个阳性对照抗体，通常用多克隆抗体。对于肽类和重组蛋白类的药物，可以做一个普通的多克隆抗体；对于Fc融合蛋白类药物，需要做独特型的抗药性抗体，因为后续不管是动物还是人的样本血清中有大量的免疫球蛋白，所以要有独特设计使它不能和Fc融合蛋白或者普通的免疫球蛋白发生反应；对于单克隆抗体药物要做特异型多克隆抗体；对于双特异性抗体法规要求临床阶段要做整个药物的免疫原性分析和每一个arm的免疫原性分析，因此既要做一个针对于整个药物的多克隆抗体，也要针对每一个arm制备多克隆抗体；对于ADC，既要做针对于整个药物的多克隆抗体，还要做针对于payload的多克隆抗体，其原因在于虽然原则上payload本身是个小分子，通常没有免疫原性，但当小分子偶联到抗体药或者载体蛋白上后则具有了免疫原性，也会产生抗药抗体，因此要专门针对payload做免疫原性分析；基因类药物属于大分子，要做针对于核酸（DNA/RNA）的抗药性抗体；细胞治疗类药物（包括CAR-T），因为它在细胞表面表达了一个异源的分子，所以要做针对于细胞外域（extracelluar domain）的抗药性抗体做免疫原性分析。
▲图4：不同大分子做ADA和PK所需要的试剂
PK分析实验需要的抗体主要是单克隆抗体对。对于Fc融合蛋白类药物，在临床前通常抗体对中的一个抗体可以用抗Fc，但因为血清中有免疫球蛋白，可能会因为洗不干净而背景高，所以到临床阶段往往不再用抗Fc，而是用两个针对于药物本身的独特型抗体来做抗体对。双特异性抗体，通常针对于每一个arm的独特型抗体，这样刚好形成一个抗体对用来做BsAb的分析。ADC类的药物因为有一个payload，在做药物全程分析时，往往一个是用独特型抗体，另外一端是用抗payload的抗体。细胞治疗类药物的PK实验一般是用流式细胞的方法来做，所以一般不需要抗体对，只需要一个单抗就可以。
那么，这些关键试剂该如何制备呢？
重组蛋白
因为在药物最初筛选和优化的过程中，往往已经生产了跟它结合的配体蛋白，这些蛋白可以直接用于PK分析。但这些蛋白用于PK分析时要考虑：这些蛋白本身制备是否容易？它的稳定性、特异性是不是好？跟抗体相比是不是有优势？如果它跟基质中的其他分子会有非特异性反应，那它就不能用于PK实验。
▲图5：重组蛋白
多数情况下，重组蛋白是优先考虑用哺乳动物细胞来生产，因为将来药物用在临床上都是人的靶点，其次才考虑其他真核系统。 通常做一个重组蛋白需要的时间比较短，这相对于抗体试剂有一定的优势，大概30天就能获得。 但临床阶段，考虑到抗体的稳定性和特异性会更好，通常优先选用抗体试剂来做生物分析。
多克隆抗体
多克隆抗体用于免疫原性分析的主要优势是抗耐药性比较好，因为一个药可以结合多个多克隆抗体另一个优势是它可以选择的物种范围非常宽，几乎所有的物种（如像小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猪、羊、猴子等）都可以用来做多克隆抗体，这样可以避免同源性。之前提到的各种各样的抗原（比如ADC药物的payload、肽、蛋白、抗体药、virus等）都可以用来做多克隆抗体的免疫原。多克隆抗体还有一个优势是制备时间短。因为它不需要做融合和克隆筛选，直接免疫动物，然后ELISA测效价，血清中有足够多的抗体就可以拿去做纯化，然后验证，整个过程大概只需要50天时间。
▲图6：多克隆抗体
案例1：多克隆抗药抗体用来做免疫原性分析的阳性对照。现在很大一部分的药是抗体药，抗体本身的结构既有恒定区，也有它可变区恒定区跟血清中的免疫球蛋白是一样的，因此靠恒定区的这部分抗体会直接跟血清中的免疫球蛋白反应，所以要把这部分抗体清除掉。制备这类抗体首先免疫动物（如兔子），然后收集其抗血清。在纯化上，要先把跟免疫球蛋白反应的抗体清除掉，通过做一个同行对照的柱子，只收集流穿液，把跟同行对照结合的多抗去除，然后用药物做亲和纯化，把跟药物结合的抗体收集。如图7，从ELISA的数据可以看出Avastin的抗体经过同行对照的清除后，只跟Avastin反应，跟同行对照IgG 1k就不反应。这样的抗体就可以用于免疫原性实验做阳性对照了。
▲图7：案例1
单克隆抗体
单克隆抗体是生物分析实验中用的最多的试剂，一般用小鼠和大鼠做。抗原和多克隆抗体一样，可以用小分子肽、蛋白、DNA。跟多克隆抗体不一样的是，单克隆抗体可以通过筛选技术，把特异性好、亲和力高的克隆筛选出来，这样可以提高所获抗体的特异性和效价；还可以筛选到具有某种特定活性的抗体，如中和活性；或者筛选到某种应用的抗体，如RHC。单克隆抗体还可以通过抗体测序、重组表达的方式来生产抗体，这样克隆不会丢失，可以重复生产，得到的抗体重复性更好，批间差更小。单克隆抗体一般需要100天的制备时间。
▲图8：单克隆抗体
案例2：用单克隆抗体做中和抗体。图9是做Humira的中和抗体，Humira是一个抗体药。首先要拿到一个Humira特异性的抗体：免疫小鼠以后，经验证若免疫反应足够好，做细胞融合，挑选阳性克隆，再进一步做亚克隆，挑选跟Humira阳性反应最好的单克隆。在挑选过程中还要做一个竞争性实验，如图，把抗体加入到Humira与其抗原结合的板后，中和抑制Humira与其抗原的结合。药明康德HitS事业部抗体团队已经成功获得Humira、Avastin、Herceptin、Erbitux、Remicade、Rituximab的中和抗体。
▲图9：案例2
抗体对
生物分析实验常用的是抗体对。抗体对，就是一个抗体用来捕获要检测的药物，另一个抗体带一个显示信号用来展示药物，通常是用生物素标记，再用HRP信号来显示。如图10，是药明康德HitS事业部抗体团队做过的Exentide-4（艾塞那肽）的抗体对。客户要求做到100pg以下，研究人员通过筛选大量的克隆，挑选高亲和力的抗体，然后通过配对筛选把高灵敏度的抗体对筛选出来，最后在普通的ELISA可以做到60pg以下，而用MSD可以做到10pg以下。药明康德HitS事业部抗体团队对生产胰岛素类以及肽类的抗体对有丰富的经验。
▲图10：案例3，艾塞那肽抗体对
针对payload的单克隆抗体
现有研发管线上，有很多ADC药物。前面已经讲ADC药物的PK分析需要一个针对payload的单克隆抗体。通过测一端是抗payload的，另一端是抗药物的抗体，从而测到完整的ADC药物。这些小分子本身是没有免疫原性的，在制备这些payload的单克隆抗体时，首先要把它偶联到载体蛋白上再用来免疫。跟其他单克隆抗体不同的是，为了避免筛选到的抗体既结合小分子，也结合抗体药物，研究人员用游离的payload来做一个竞争ELISA，若可以完全竞争性抑制掉抗体与payload的结合，则证明payload抗体只跟payload结合。药明康德HitS事业部抗体团队的实验室成功完成过多个常用ADC药物的payload抗体制备，包括MMAE、DM-1等。
▲图11：案例4
伴随诊断类的抗体
伴随诊断类的抗体通常是单克隆抗体。前期免疫筛选的流程也基本上类似于其他的单克隆抗体。因为现在除了突变类的伴随诊断用PCR的方法，针对于表达水平异常的伴随诊断多数是用IHC的方法，所以在单克隆抗体筛选的过程中，需要筛选IHC阳性抗体，这对抗体的性能提出了更高的要求。要做到可用于临床使用的试剂，大量的验证工作，包括特异性、灵敏度、精准度、稳定性等是必须的。整个伴随诊断的流程，首先要筛选到抗体，然后做IHC应用的验证，通过注册检测才可以跟临床药品搭在一起做临床实验。临床实验阶段会根据药效进一步确定IHC诊断的cut-off值和病理分析的方法，做完临床实验以后才会做第三类医疗器械的申报。伴随诊断适用于第三类医疗器械的管理，其他试剂没有这些法规要求。
▲图12：案例5
关键试剂的质量控制
关键试剂的质量控制是全过程控制。整个制备流程大概设了11个检验点，包括项目设计，抗原准备，动物免疫流程，到蛋白抗体纯度与ELISA效价特异性。每一个检验点都有数据指标，专职QA人员检查这些过程并出具COA。例如抗原的纯度需＞95%，动物免疫的效价需>1:32000，抗体的纯度>95%。对于特异性和免疫原性实验用到的抗药抗体的阳性对照，要求在一定浓度下，抗体和药物反应大于对照组10倍。
▲图13. 质量控制与质量保证
文件系统
生物分析的试剂是不需要做GLP或者临床实验申报的，但属于核查范围之内。NMPA可以要求核查这些实验中用到的关键试剂，其中很重要的一部分包括文件系统。药明康德HitS事业部抗体团队提供的服务可以配合NMPA做核查，包括符合质量要求的试剂COA。
▲图14. 核查关键试剂需要的文件系统
药明康德HitS事业部抗体团队做生物分析的优势
从2013年开始，药明康德HitS事业部抗体团队开始做大分子药物、生物药的生物分析。包括单克隆抗体、双特异型抗体、ADC、CAR-T、重组蛋白类、肽类、胰岛素类等，对这些药物的分析和试剂制备的具有丰富的经验。
药明康德HitS事业部抗体团队的优势：1）完整的抗体开发平台。自2000年开始，团队已拥有20年抗体开发经验，累计开发超过2万种抗体。2）可以快速完成抗体或蛋白试剂的开发。交付时间蛋白30天、多克隆抗体50天、单克隆抗体100天。3）拥有药明大平台符合国际要求的高标准资源，包括AAALAC动物房、400 ATCC细胞库、ISO90012015的质量体系等。
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