王玉成团队开发基于CRISPR

　　

　　CRISPR-Cas9系统具有编辑的精度高、简便、高效等优点，是重要的基因编辑技术。将CRISPR-Cas9系统中的Cas9的D10A 和H841A定点突变后，称为dead Cas9 (dCas9)。该蛋白失去了切割DNA的核酸酶活性，但其仍可以在gRNA的引导下与目的DNA序列结合。因此，CRISPR-dCas9系统可以特异地识别并结合在目标DNA位点，但不切割该位点，具有广泛的用途。

　　近日，东北林业大学王玉成教授团队在Plant Physiology在线发表了题为 “A Reverse Chromatin Immunoprecipitation technique based on the CRISPR dCas9 system” 的研究论文，利用dCas9这种性质，建立了名为Reverse Chromatin Immunoprecipitation technique based on the CRISPR dCas9 system (R-ChIP-dCas9)技术，用于目标染色质DNA结合蛋白的分离。

　　

　　该技术先突变Cas9为dCas9。然后，将dCas9与Strep-Tag II融合(以下简称为dCas9-Strep)构建CRISPR-dCas9-Strep植物表达载体，并根据目标DNA的序列合成gRNA序列，进而构建能够识别目标DNA序列的CRISPR-dCas9-Strep植物表达载体，并转化农杆菌。利用该团队建立的基于农杆菌的瞬时转化方法将其瞬时转化到植物细胞内，在gRNA的引导下，dCas9-Strep特异地结合在目标基因组位点。然后，将蛋白和染色质DNA进行甲醛交联，交联后再进行细胞核分离，染色质分离和染色质的超声波破碎。再利用Strep-Tactin磁珠来特异性地结合dCas9-Strep，进而分离出目的染色质片段及相应的DNA结合蛋白。最后，通过质谱对DNA结合蛋白进行分析鉴定(图1)。

　　

　　图1 R-ChIP-dCas9原理

　　对于DNA结合蛋白的验证，首先构建该蛋白与Flag融合基因的植物表达载体，再瞬时转化到植物中，利用Flag抗体进行ChIP，然后用ChIP-qPCR验证该蛋白是否特异结合目的DNA序列，并用EMSA进一步验证。

　　R-ChIP-dCas9技术不依赖于是否有稳定的遗传转化系统，凡是能被农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化的植物理论上都可以应用，能快速、准确地分离出目的DNA所结合的蛋白，尤其对基因的上游调控蛋白鉴定具有重要意义，应用前景广阔。

　　东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室的博士研究生王智博、贺子航作为该论文的并列第一作者，王玉成教授作为通讯作者。研究团队的高彩球、王超教授和研究生刘竹君、曲铭也参与了相关工作。本研究获得了国家自然科学基金(No. 31971684)和黑龙江省头雁创新团队(林木遗传育种创新团队)的资助。

　　论文链接：

　　https://doi.org/10.1093/plphys/kiac506

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