流式课堂｜流式实验该准备多少管样本？如何设置对照？

　　实验过程中，老师们或许会有疑问：一个完整的流式实验中，到底需要几种对照，需要准备多少管样本来设置对照呢？

　　下面，我们为大家总结6种常见的流式对照设置，并以CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PE三色实验为示例，为大家提供样本管设置参考。

　　01

　　空白对照——用于调节仪器电压

　　空白对照，即不添加任何荧光染料的对照管。设置空白对照，是为了区分细胞本底的自发荧光，及判断药物处理等外界因素是否会额外引入自发荧光。

　　此外，空白管细胞为可能存在的最负阴性总群体的位置，能辅助电压的调节，避免上机时因电压过低导致的阴性细胞群压线。

　　02

　　单阳对照——用于多色补偿调节

　　单阳对照即单阳管，是只添加一种荧光抗体的样本管。多色流式实验中，由于荧光素的发射波长覆盖范围较广，荧光可能产生重叠，对实验结果的数据分析造成一定的干扰。此种情况下，我们通常会设置单阳管进行补偿调节。同时，单阳管还可以辅助我们调节通道电压，防止信号超出接收范围。

　　一般来说，实验panel有几种荧光，就需要设置几个单阳管。

　　(a)补偿前

　　(b)补偿后

　　图1 单阳管校正光谱重叠：CD4-FITC单染的淋巴细胞，在PE通道中检测到荧光(a)，但在正确补偿后，FITC荧光溢漏到PE通道的信号被正确扣除(b)。

　　03

　　同型对照——用于设门

　　同型对照（Isotype Control），是指与使用的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量和浓度，但对目标靶点无特异性结合的抗体。同型对照通常用来消除抗体的非特异性结合造成的背景染色。

　　图2 同型对照用于确定门的位置：Human CD38在人外周血淋巴细胞中，是连续性表达指标。用不染任何抗体的空白管（蓝色）划门，和染对应抗体的同型对照（黑色）划门对比。

　　04

　　FMO对照——用于设门

　　FMO对照是Fluorescence Minus One（荧光扣除一）的缩写。在多色实验中，可能会出现某些通道信号难以区分的情况，主要原因是其他某个荧光对该通道的干扰很大，不能使用未染色的空白对照或全部用同型对照来设门。要记住，每增加一种荧光，整体荧光渗漏等情况都会发生改变，因此需要使用荧光扣除对照（即依次在所有的荧光标记中去掉一个）。

　　图3 FMO对照划门更准确：以空白管来确定阴性细胞群（灰色线）和以FMO对照来确定阴性细胞群（红色线）对比。

　　05

　　FMO联合同型对照——用于设门

　　FMO联合同型对照，即FMO与被去掉的抗体对应的同型对照抗体的“组合”对照。FMO对照和同型对照反映的是两种类型的背景荧光，因此，在多色流式实验时，单独使用其中的一种来设门并不可靠。目前，人们试图结合FMO（考虑荧光溢漏）和同型对照（考虑抗体非特异性结合）来设门，该方法也是目前杂志投稿比较容易接受的对照。

　　06

　　实验对照——用于解决科研问题

　　实验对照，也叫生物学对照，不用于设置补偿或设门，而是用于比较样本与特定实验条件下的标本之间的差别。例如，在研究某种药物对某细胞株的影响时，需要设置未经药物处理的相同细胞株作为实验对照。

　　示例：完整的CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PE的3色实验样本管设置

　　

　　注：“-”表示不加抗体，“*”表示加入对应的同型对照

　　说明：

　　1. 一般来说，像CD3、CD4、CD8这种分群明显的指标，不需要设置同型对照；

　　2. 是否需要设置FMO对照，视荧光的干扰程度而定。本实验中，可以不设置FMO联合同型对照；

　　3. 对于这种荧光干扰小的Panel（如本实验），首次实验时，建议做单阳对照，后期可以不设置单阳对照。如果是新手老师，建议每次都做单阳管。

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