砥砺深耕，知“微”见著——杨燕宁教授谈角膜缘干细胞微环境的重要性
编者按
随着现代医学的不断进步，眼科领域也有了突飞猛进的发展，角膜病的分类及学术研究越来越精细、深入。角膜缘干细胞可在角膜上皮细胞更新及损伤修复中起到重要作用，角膜缘干细胞微环境任何组成部分的显著病变均可导致角膜缘干细胞功能障碍，进而导致角膜缘干细胞缺乏症。在2022中国角膜病论坛暨第二十一届全国角膜及眼表疾病学术大会暨第十四届全国角膜屈光手术年会 （CCCRS 2022)上，武汉大学人民医院杨燕宁教授通过分享相关病例深入剖析了角膜缘干细胞微环境的重要性，为更好地治疗患者提供了宝贵经验。
力学笃行，实践出真知
病例一
患者为67岁女性，主诉为右眼红肿、眼痛、异物感半月。患者于2019年外院行右侧三叉神经射频消融术；曾于当地医院诊断为“右眼角结膜炎”，予以配戴治疗性角膜接触镜、局部抗感染、润滑、保护上皮治疗。
查体：视力：Vod 0.02，Vos 0.8；眼压：OD Tn，OS 15 mmHg。
诊断：右眼神经营养性角膜病变、双眼干眼、双眼MGD、右侧三叉神经射频消融术后。
治疗：右眼羊膜移植术（AMT）、局部抗炎抗感染润滑联合自体血清治疗。
患者行AMT术1月后可见右眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度及形态改善。
病例二
患者为65岁女性，主诉为左眼眼痛伴流泪1月，加重2天。
现病史：患者1月前因右眼渐进性眼痛于外院诊断为“双眼糖皮质激素性青光眼，左眼角膜上皮缺损”，予以抗病毒、抗细菌、降眼压及人工泪液等6种滴眼液点眼近1月。
既往史：2020年12月诊为膜性肾病，口服糖皮质激素及环磷酰胺冲击治疗8月余；冠心病史3年余，口服阿司匹林；高血压10余年。
查体：矫正视力：Vod 0.8，Vos 0.2；眼压：OD 15 mmHg，OS 18 mmHg。右眼角膜上皮粗糙，下方角膜沟状溃疡；左眼中央角膜上皮大块缺损，基质水肿。
右眼
左眼
诊断：双眼药物毒性角膜病变、双眼干眼、MGD、膜性肾病、高血压、冠心病。
鉴别诊断：病毒性角膜炎、自身免疫相关性角膜炎。
治疗：双眼：局部润滑治疗；左眼：AMT（双层）、局部抗炎治疗。
患者两周复查羊膜拆线后，可见右眼角膜上皮完整光滑，角膜知觉减退；左眼中央上皮缺损，角膜知觉消失。杨燕宁教授随即调整治疗方案，给予患者双眼局部重组人神经生长因子（rhNGF）治疗。
经过八周治疗，患者双眼角膜知觉均得到改善。左眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度及形态改善、神经纤维增多。左眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度增多。
病例三
患者为44岁女性，主诉为清洁剂（管道疏通剂）溅入双眼1天。急诊大量生理盐水反复冲洗。
查体：视力：Vod 0.05，Vos FC/10 cm；眼压：OD Tn，OS Tn。
诊断: 双眼化学烧伤、左眼眼睑闭合不全。
患者进行五次AMT手术后复查，可见右眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度及形态改善、神经纤维增多。右眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度逐步趋于稳定。
患者随后复查诉右眼视物模糊，查体显示：Vod为LP，晶状体白混，左眼角膜中央上皮缺损，周围新生血管长入。杨教授会诊完患者后行右眼白内障超声乳化抽吸联合人工晶状体植入术，术后患者视力提升。
病例四
患者为34岁男性，主诉溅入防水涂料2天，自行用自来水冲洗、外院生理盐水冲洗，予以左氧氟沙星滴眼液，妥布霉素地塞米松眼膏、维生素A眼用凝胶点眼。
查体：视力：Vod 0.1，Vos LP；眼压：OD Tn，OS Tn。
诊断：双眼化学伤（右眼II级，左眼V级）。
杨教授当即给予患者双眼结膜囊冲洗+角膜清创+AMT+左眼前房冲洗术，给予局部抗炎、抗感染、扩瞳及润滑等药物治疗，于2021年8月27日行左眼AMT及睑裂缝合术，2022年4月20行左眼角膜缘上皮组织移植（SLET）+AMT。
经过治疗后，患者左眼中央角膜基底细胞及各方位角膜缘干细胞密度及形态改善。
原始见终，寻根究底
杨燕宁教授在几十年的临床工作中不仅积累了丰富的临床经验，同时还在角膜病科学研究方面深耕不辍。杨教授团队目前已经可以通过AI自动识别IVCM图像中央基底细胞及角膜缘干细胞区域，为更好地研究角膜缘干细胞提供了更先进便利的条件。
角膜上皮是一种自我更新的组织，来源于角膜缘干细胞。角膜缘干细胞在角膜上皮修复中起着重要作用，角膜上皮损伤种类繁多，杨教授结合临床实践和国内外研究报道总结了影响角膜上皮损伤修复的潜在病因及机制，同时提出角膜上皮损伤的愈合包括细胞迁移、增殖、粘附和分化过程，该过程涉及生长因子/细胞因子和细胞外基质（ECM）信号介导的相互作用。上皮伤口愈合的动力学包括两个不同的阶段：初始潜伏期和闭合期。
角膜缘上皮干细胞（LESCs）是一组成体干细胞，位于角膜缘上皮的基底层，其特征是分化程度低及具有自我更新能力，可维持角膜上皮表面的稳态和透明度。角膜缘干细胞的增生及相关特性离不开微环境的协调，角膜缘干细胞微环境主要包括支持细胞（间充质干细胞、免疫细胞、黑色素细胞、血管细胞和神经细胞）、ECM和信号分子（生长因子和细胞因子等）。角膜缘间充质干细胞与LESC之间存在物理性的连接，间充质干细胞通过整合素 α8（integrin α8）和肌营养不良多糖附着于基底膜。此外，间充质干细胞投射通过基底膜，与LESC直接接触。角膜神经与上皮细胞/基质细胞相互作用维持着角膜的正常微环境。
杨教授强调，角膜缘干细胞微环境任何组成部分的显著病变均可导致LESC功能障碍，导致角膜缘干细胞缺乏症（limbal stem cell deficiency，LSCD）。LSCD的临床特征主要包括角膜上皮结膜化（LSCD的标志）、持续性或复发性上皮缺损、伴有或不伴有角膜新生血管、眼表炎症和瘢痕形成。LSCD可单独存在或与眼表疾病及免疫系统疾病共存。
在活体共聚焦显微镜下可以看到正常角膜缘干细胞和轻、中、重度角膜缘干细胞缺乏之间的明显区别。
正常：翼状细胞及基底上皮细胞（边界清晰、胞质深、无细胞核）基底神经（nerve，N）丛可见、Vogt栅栏（高反射、双轮廓线性结构）；
轻度：上皮细胞边界不清、细胞核明显、基底N丛密降低、Vogt结构轻度改变、血管中见大量炎细胞及树突细胞；
中度：翼状细胞畸形、基底细胞及N丛进一步恶化、Vogt不可见、角膜缘上皮细胞变大；
重度：可见化生上皮细胞、Vogt结构完全消失。
结合临床表现，角膜基底细胞密度（basal cell density, BCD）、中央角膜上皮厚度（CET）和角膜神经纤维长度（CNFL）的综合分期系统，能够准确、客观地诊断LSCD并对其严重程度进行分期。
目前LSCD的治疗原则主要是LESCs的再生以及重建角膜缘干细胞微环境。眼表优化是LSCD初始管理的重要步骤，在手术前应治疗所有合并症以优化眼表。LSCD的治疗取决于LSCD的严重程度和范围，对于无症状的局部LSCD患者，建议泪膜重建和炎症抑制；有症状的LSCD患者，除眼表优化外，考虑手术治疗。
LESCs的再生主要依靠角膜缘干细胞移植，而重建角膜缘干细胞微环境的主要策略包括减轻炎症和恢复细胞与细胞外基质的正常功能：
生物活性细胞外基质用于角膜缘干细胞微环境的重建（羊膜移植；ECM水凝胶、胶原蛋白、纤维蛋白、硅氧烷水凝胶隐形眼镜和丝素蛋白）；
恢复角膜缘干细胞微环境的信号分子（血清或血浆衍生的滴眼液、羊膜提取物滴眼液）；
恢复角膜缘干细胞微环境的细胞方法（MSCs）。
羊膜具有抗炎、抗血管生成和抗纤维化特性，已成为组织工程和细胞递送中的有效工具，但由于羊膜的不透明性及在移植后不久就会被消化，其作用只是暂时有效。利用含有LESC的角膜缘组织以及组织培养扩增细胞，扩增细胞放置在具有特定生态位结构和ECM成分的支架上，将其转移到患病的眼睛。广泛的生物和合成材料已被确定为LESC的载体支架，其中一些已用于临床，包括羊膜、纤维蛋白和硅水凝胶隐形眼镜。
动物实验观察到，羊膜提取物滴眼液（AMEED）可以促进离体角膜缘干细胞生长，限制离体角膜细胞分化，促进角膜缘干细胞扩增，促进兔角膜上皮愈合。杨教授通过临床病例观察发现眼化学烧伤后手术治疗后，使用AMEED治疗的病例组所有眼角膜上皮缺损均愈合，对照组所有眼都出现了持续性上皮缺损，因此AMEED可能有助于角膜缘干细胞的体内增殖。
结膜下注射MSCs治疗LSCD的优点是微创、允许以小容量给药高剂量的细胞，不需要任何广泛的额外细胞培养步骤，无需手术，方法简单，无需额外的注射后干预，减少时间和成本。结膜下注射MSCs治疗LSCD的缺点是部分实验观察到注射的MSCs并没有从注射部位迁移到角膜。结膜下注射MSCs治疗LSCD只进行到动物实验阶段。使用细胞载体进行MSC移植治疗LSCD目前还处于临床实验阶段。
小结
角膜上皮的更新及损伤后修复有赖于角膜缘干细胞功能正常，而角膜缘干细胞的增生及相关特性受干细胞微环境的调控影响。杨燕宁教授认为重视角膜缘干细胞微环境对角膜修复意义重大，通过改善角膜缘干细胞生存微环境，有助于角膜表面重建，最终造福患者。
专家简介
杨燕宁
主任医师，博士生导师
德国ESSEN大学临床医院眼科 MD 博士，美国 UCSD Shiley 眼科中心博士后，德国杜塞尔多夫大学神经解剖学系访问学者。主持国家自然科学基金面上项目三项、中国工程院咨询研究项目、湖北省自然科学基金面上项目、教育部留学 归国人员基金等项目。
科室及职务:武汉大学人民医院眼科中心副主任兼眼 II 科主任
诊疗专长:眼前节疾病尤其是白内障、青光眼及角膜病眼表疾病的诊治
学术任职与荣誉:
中华医学会眼科学分会角膜病学组委员
中国医药教育协会智能医学专业委员会智能眼科学组常委
中国老年学和老年医学学会眼科学分会常委
中国医师协会医学科学普及分会眼科科普专业委员会委员
中国女医师协会眼科专业委员会委员
海峡两岸医药卫生交流协会眼科专委会眼表与泪液疾病学组委员
湖北省生物医学工程学会眼生物材料专业委员会主任委员
湖北省眼科学会常务委员
湖北省中西医结合眼专业委员会副主任委员
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