SHR、WKY大鼠与SD大鼠注意缺陷多动障碍模型行为学特征的比较
【摘要】目的比较SHR、WKY、SD大鼠行为学特征，探寻研究SHR大鼠注意缺陷多动障碍(ADHD)理想的对照模型。方法运用旷场实验统计大鼠运动距离、运动速度、穿格数及理毛次数来评价SHR、WKY、SD大鼠自主运动情况;运用水迷宫实验检测三组大鼠的学习记忆能力。结果旷场实验结果显示，SHR大鼠在总运动量、平均运动速度及穿格次数上较WKY及SD大鼠均显著增加(P＜0.01);与WKY大鼠相比，SD大鼠运动距离显著高于WKY组(P＜0.01)，其运动速度及穿格数略高于WKY组(P＜0.05);水迷宫隐匿站台实验中，与SHR大鼠相比，SD大鼠潜伏期较长(P＜0.05)，在潜伏期运动距离上，SD大鼠在训练第1天、第3天及第4天运动距离较SHR大鼠延长(P＜0.05或P＜0.01);比较WKY组，SD大鼠潜伏期及潜伏期运动距离较WKY在各个训练时间均有不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)。在空间探索阶段，SD大鼠穿台次数及目标象限运动时间、距离比率等均较SHR大鼠有所减少(P＜0.05)，而较WKY大鼠则有不同程度的升高(P＜0.05或P＜0.01)。结论WKY大鼠与SHR大鼠行为学差异过大，两者的比较存在一定的不足，增设SD大鼠作为SHR大鼠的对照组能够提升SHR大鼠行为学特征的可比性，更为客观的反映SHR大鼠的行为学特征。
水迷宫动物模型是开展动物实验的基础，是人类探究疾病病因病机、掌握疾病发展规律的主要手段。模型动物为人类的健康做出了巨大的牺牲和无法替代的贡献，是否拥有良好的动物模型已经成为决定一个学科对某种疾病研究的广度和深度的先决条件。
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对于精神神经系统疾病而言，在对疾病的病因病机研究中，因受临床样本缺乏和伦理学的限制，理想的动物模型对精神神经系统疾病的机理研究意义重大。注意缺陷多动障碍(attentiondeficit/hyperactivitydisorder，ADHD)是儿童时期常见的精神神经系统疾病，全球儿童发病率约为5.9%。ADHD病因复杂，发病机制至今未明。研究表明，环境因素、遗传因素、家庭心理因素、饮食因素等都与本病息息相关。ADHD以注意力不集中，多动、冲动为核心症状，这些症状会给个人、家庭及社会带来诸多不良影响，且有研究证实ADHD与犯罪行为存在密切关联。因此，深入研究ADHD关系儿童健康，关系家庭幸福和社会稳定。
ADHD的动物模型研究开展的相对广泛，作者总结了当前的ADHD动物模型主要存在如下四大类:第一类为应用遗传学突变制备的遗传学模型;第二类为运用物理化学手段制备的脑神经损伤模型;第三类为在正常大鼠群体中人工筛选的符合ADHD行为学特征的动物模型;第四类为调控环境因素制备的环境适应性模型。这些模型对人们认识该疾病做出了重要贡献，推动了ADHD病因病机研究的不断进展。众多动物模型中，当前国际上应用最为广泛的ADHD动物模型为幼年自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat，SHR)，SHR大鼠起源于东京远交系Wistar大鼠，是Okamoto等在1963年运用选择性近亲交配法培育的WistarKyoto(WKY)大鼠的基础上，经过交叉培育而成。SHR大鼠在10周龄之前基本不表现高血压症状，在4～10周龄之间呈现出典型ADHD的症状，且在生理学上，4周龄大鼠在发育上相当于人类儿童期的开始，因此4～10周龄SHR大鼠因更接近儿童ADHD的症状而被广泛应用。但随着SHR的广泛应用，越来越多的学者质疑SHR大鼠的代表性，尤其对于其天然对照组WKY大鼠，学者发现在行为学测试中WKY大鼠比其他种系大鼠自主活动性较低，并表现出抑郁样特征，且在水迷宫实验中存在漂浮不动现象，不符合一般大鼠的生理特征，因此两者的比较缺乏客观真实性，WKY大鼠是否可作为SHR大鼠的最佳对照组争议较为激烈。有学者提出了增加Sprague-Dawey(SD)大鼠作为SHR大鼠的对照组要优于WKY大鼠的观点。
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基于以上不同学术观点和学界的激烈争论，作者从行为学实验着手，针对ADHD多动、冲动、注意力不集中的核心症状，运用旷场实验及Morris水迷宫(Morriswatermaze，MWM)实验相结合的方法，对SHR、WKY、SD大鼠三者的行为学特征进行比较研究，初步观察三者的行为学差异，为筛选理想的ADHD模型及对照组提供数据支撑。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
SPF级，雄性，4周龄SHR、WKY、SD大鼠三组，每组10只。SHR大鼠体重(78.26±4.76)g;WKY体重(76.41±4.73)g;SD大鼠体重(80.32±3.87)g。。温度、湿度控制在20～24℃、45%～55%，调整昼夜节律，大鼠自由进食(实验动物中心提供啮齿类动物标准颗粒饲料)及饮水。。
1.1.2实验仪器设备包括黑色旷场实验箱(90cm×90cm×30cm)，水迷宫实验装置(1.6m×0.5m)及水温恒定系统，小动物行为活动记录分析图像采集电脑控制系统(SLY-ETSVersion1.66)。
1.2实验方法
所有行为学实验于大鼠适应环境1周后进行，实验开始前提前将大鼠置于实验环境下1h。
1.2.1 旷场实验(Openfieldtest)
旷场实验箱为黑色，运用小动物行为活动记录分析系统将实验箱底部分为18cm×18cm的25个方格。旷场实验于白天9:00－17:00进行，将大鼠轻柔置于实验箱中央区域，电脑软件统计大鼠的运动距离、运动速度、中心运动距离、穿格次数等数据，每只大鼠每天实验1次，每次5min，连续进行4d进行统计分析。每只动物实验结束后，清除动物粪便，消毒液清洗实验箱底部及内壁，然后用75%酒精擦拭，风扇吹干后放入下一只动物。
1.2.2 Morris水迷宫实验(Morriswatermaze)
水迷宫宫体内部为黑色，宫体内充水高度约30～35cm，通过水温恒定系统固定水温至(23±2)℃。站台高约29～34cm，直径12cm，表面粗糙。将水迷宫分为四个象限，站台固定放置于西南象限中央区域，约低于水平面0.7～1cm。水池上方设置60瓦灯泡，放置高度以不被摄像头捕获为宜，水池四周用黑色遮光布包围以避免外部环境干扰。水池周围高于水平面位置放置4～5个10cm大小、形态各异的黑色几何图形作为空间参照物。实验分为连续5d，第1～4天为隐匿站台实验，每天从不同入水部位训练4次，每次120s，训练间隔为30s，观察各组大鼠潜伏期及潜伏期运动距离的变化。因每个象限与站台的距离不同，为防止固定顺序的入水位置及不同的入水距离对实验结果的影响，本实验入水位置参照Charles计算后的入水方法进行，尽量保持入水顺序的变化和距离的相同。第5天为空间探索实验，撤除站台，将大鼠从东北象限放入，统计120s内大鼠的穿台次数及在目标象限内游泳时间和距离占总时间和总距离的百分比以评价大鼠的学习记忆能力，实验进行2次求均值。实验结束后用干毛巾擦拭动物，并用吹风机将大鼠吹干后放入笼内。
1.2.3 数据统计
采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料采用x珋±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD和Dunett法，以P＜0.05为差异有统计学意义，图表制作采用GraphPadPrism6.0软件完成。
2 结果
2.1 SHR、WKY、SD大鼠旷场实验数据
旷场实验结果显示，SHR大鼠在总运动量、平均运动速度及穿格次数上较WKY及SD大鼠均显著增加(P＜0.01);与WKY大鼠相比，SD大鼠运动距离显著高于WKY组(P＜0.01)，其运动速度及穿格数略高于WKY组(P＜0.05)，SD大鼠的运动距离、运动速度、穿格数及理毛次数等数据均介于WKY与SHR大鼠之间，其综合运动能力优于WKY大鼠。而WKY大鼠综合运动能力与SD大鼠相比较弱(P＜0.05)，且与SHR大鼠差距过大，可比性较差，如表1及图1所示。
2. 2SHR、WKY、SD大鼠水迷宫实验数据
水迷宫实验入水位置如表2所示，在隐匿站台实验中，与SHR大鼠相比，SD大鼠潜伏期在训练第1天、第2天潜伏期较长(P＜0.05)，在潜伏期运动距离上，SD大鼠在训练第1天、第3天及第4天运动距离较SHR大鼠延长(P＜0.05或P＜0.01);比较WKY组，SD大鼠潜伏期及潜伏期运动距离较WKY在各个训练时间均有不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)，如图2．A、B所示。在空间探索阶段，SD大鼠穿台次数及目标象限时间、距离比率等均较SHR大鼠有所减少(P＜0.05)，而较WKY大鼠则有不同程度的升高(P＜0.05或P＜0.01)，如图2．C、D所示。
3 讨论
旷场实验是评价动物自主运动能力的常用实验方法，广泛应用于多学科的实验研究。在ADHD的行为学研究中，国外经常将旷场实验中大鼠的运动距离及运动速度作为评价ADHD多动、冲动两大核心症状的重要依据。通常情况下，实验将运动距离的长短作为评估多动行为的依据，运动速度的快慢作为大鼠激惹冲动状态评定标准，具有一定的说服力。Morris水迷宫实验作为评价动物学习记忆能力的经典实验方法，在国外众多文献中常用来从侧面评价ADHD注意力不集中这一核心症状的严重程度。因此，本实验选取这两种常用的ADHD动物模型行为学检测方法来比较三种动物的行为学特征。
本次实验以SD大鼠为比较对象，重点研究SD大鼠与SHR大鼠、WKY大鼠的行为学差异。在旷场实验中，SHR大鼠在运动距离、运动速度、穿格数及理毛次数上均较SD大鼠显著增加(P＜0.01)，表现出了多动、冲动的特征。而与WKY大鼠相比，SD大鼠的运动距离、运动速度及穿格数则有不同程度的提升(P＜0.05或P＜0.01)。总结而论，在运动能力上，SD大鼠的运动能力介于SHR大鼠及WKY大鼠之间，与SHR大鼠差异较为明显。WKY大鼠作为SHR大鼠的天然对照组，其运动能力与SHR大鼠差异巨大，两者的可比性需要进一步研究。在MWM隐匿站台实验中，SHR大鼠的潜伏期较SD大鼠缩短(P＜0.05)，潜伏期距离在实验第3天、第4天也较SD大鼠显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，SHR大鼠的学习记忆能力强于SD大鼠。而在与WKY大鼠的比较中，SD大鼠的潜伏期及潜伏期运动距离均较WKY大鼠显著下降(P＜0.01)，其学习记忆能力亦介于两者之间。WKY大鼠在MWM实验中经常出现浮于水面的静止状态，其潜伏期较SHR大鼠及SD大鼠均有较大差异(P＜0.01)。在空间探索实验阶段，SD大鼠穿台次数及目标象限运动比率较SHR大鼠略有下降(P＜0.05)，而较WKY大鼠则有不同程度的升高(P＜0.05或P＜0.01)。通过对MWM实验结果的总结发现，SHR大鼠在MWM实验中虽表现出了较SD大鼠稍好的空间学习记忆能力，这一现象与临床上ADHD患儿伴见学习困难的症状略有差异。但从轨迹图中分析可以看出(图3)，SHR大鼠在相同时间
内的游泳距离较SD大鼠显著延长，在水迷宫相对有限的空间内，其穿台次数及目标象限运动比率较SD大鼠的提高可能存在概率上的差异，且在隐匿站台实验阶段，SD大鼠与SHR大鼠在实验后期两组的潜伏期无差异，因此，空间探索阶段的结果并不能完全表明两者在学习记忆能力上存在显著差异;其次，ADHD患儿临床表现出的注意力不集中及学习困难原因众多，空间学习记忆能力只能作为其中一个参考指标。关于这一现象，作者在后期的实验中会展开大样本、多途径的实验研究加以验证。而WKY大鼠在MWM实验中表现出过低的学习记忆能力，与SHR大鼠的可比性较低，甚至出现与大鼠恶水这一生理现象相反的行为表现。有研究报道亦指出WKY大鼠存在水上漂浮现象，且存在不同程度的抑郁症状，这些表现使WKY大鼠与SHR大鼠的行为学比较缺乏可比性和可信度，单从MWM实验结果而论，WKY大鼠并非SHR大鼠的理想对照模型，增加SD大鼠作为对照或能更好的反映SHR大鼠的行为能力。
通过本次实验作者发现，SHR大鼠存在典型的多动、冲动行为，能够较好的模拟ADHD多动、冲动量大核心临床症状，MWM实验虽能从学习记忆能力上侧面反映SHR大鼠的注意力状况，但并非对注意力的直接检测，注意力的行为学检测需要进一步的研究。WKY大鼠存在运动能力过低的现象，且在MWM实验中表现异常，这一定程度上影响了实验的可比性和真实性，WKY大鼠是否是SHR大鼠的理想对照模型有待探讨。SD大鼠的运动能力和学习记忆能力介于两者之间，其行为表现未出现异常，且在与SHR大鼠的比较中较好的体现了SHR大鼠多动、冲动的行为特征，SD大鼠具有替代WKY大鼠成为SHR大鼠对照模型的行为条件，且SD大鼠易于获得，价格较低，有助于动物实验的推广。但也要指出，仅从行为学角度探讨三种模型的优劣缺乏系统的证据，理想的ADHD动物模型需符合以下特征:(1)能模拟ADHD基本的行为学特征;(2)用精神兴奋剂治疗有效;(3)与临床提出的一些合理的病理生理学假设相吻合;(4)能对ADHD在遗传学、神经生物学、治疗等方面研究提供预测作用。因此，SD大鼠及WKY大鼠谁更适合成为SHR大鼠的理想对照模型尚需更深更广的研究。但可以指出，WKY大鼠与SHR大鼠的比较存在一定的不足，需要学界引起重视，在目前的实验研究中，增设SD大鼠作为SHR大鼠的对照组能够增加SHR大鼠行为学特征的可比性，更为客观的反映SHR大鼠的行为学特征。