鱼类低氧耐受基因及其用图

　　鱼类低氧耐受基因及其用图

　　【专利摘要】本发明公开了一种具有提高鱼类低氧耐受能力功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如(a)或(b)或(c)或(d)所示：(a)如SEQ ID NO:1所示；(b)如SEQ ID NO:2所示；(c)编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码巯基特异性抗氧化蛋白的核苷酸序列。本发明还公开了该核苷酸序列蛋白质、重组载体或宿主细胞用于提高鱼类低氧耐受能力和耐低氧转基因鱼品种培育中的用途。将其作为转植基因整合进入受体鱼类基因组，并有效表达后，能够显著提升受体鱼细胞和机体的低氧耐受能力。

　　【专利说明】

　　鱼类低氧耐受基因及其用途

　　技术领域

　　[0001] 本发明属于鱼类基因工程技术领域，特别涉及一种鱼类低氧耐受基因及其用途。

　　【背景技术】

　　[0002] 普通大气压下，水中氧气的溶解度仅相当于同体积空气中氧含量的1/30,且水中 氧气扩散速度比空气中慢得多，植被或冰层覆盖、温度梯度、盐度梯度都能够引起局部水体 含氧量急剧下降。由于水体中氧供应有限，养殖物种的低氧耐受能力成为影响水产养殖密 度的重要因素，对于耐低氧鱼类如乌鳢、镜鲤等，通过合理的养殖模式优化，可以实现"一塘 水、半塘鱼"的高效集约化养殖，而对于不耐低氧的鲑鳟鱼类、舌鳎等，则必须控制较低的养 殖密度，并随时监控水体溶氧状况，及时采取物理(如氧气栗)或化学（如增氧剂）的人工增 氧措施。

　　[0003] 因此，改善养殖鱼类的低氧耐受能力对于发展节水、低碳的环境友好型现代水产 养殖业具有重要意义。此外，耐低氧能力的提升，也能使养殖鱼类在运输和上市售卖环节更 易于保持鲜活，提升水产品品质。

　　[0004] 转基因是一种行之有效的遗传改良手段，它通过基因工程技术，将外源基因片段 导入并整合到受体物种基因组内，从而提升或改变目标物种的表型性状，并能够产生稳定 遗传的后代。世界上首例转基因鱼模型于1985年由我国科学家报道，朱作言院士课题组使 用小鼠金属硫蛋白I型基因启动子驱动人生长激素基因，培育出快速生长的转基因金鱼 (Zhu Z Y et al.，Z Angew Ichthyol，1985,1:31-34)。

　　[0005] 经过30余年的发展，多种有效的鱼类转基因技术方案已成功确立，并在鲑鳟鱼、鲤 鱼、草鱼、罗非鱼、泥鳅、黄颡鱼、鲶鱼、斑马鱼等物种中得到应用。一些涉及生物伦理和生物 安全的转基因科学观念也逐渐形成共识，例如以商品化生产为目标的转基因鱼类研发宜使 用"全鱼"转基因策略，即所有的转基因元件，包括表达调控序列、转入的外源基因，都来源 于鱼类，而非远缘动植物、微生物，尤其是人类。2015年11月，全球首例可食用转基因鱼-转 基因大西洋鲑AquAdvantage，获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，它是将大鳞大 马哈鱼生长激素基因置于美洲绵躕抗冻蛋白基因启动子驱动之下，共同转入大西洋鲑基因 组内构建的转基因鱼新品种，重组的全鱼生长激素基因可使转基因鱼达到上市规格的生长 周期从3年左右缩短到18个月。

　　[0006] 然而目前报道的被转入鱼类基因组内的外源基因多数是生长激素基因，以及用于 观赏鱼的荧光蛋白基因，抗逆基因数目很少，其中耐低氧转基因的报道仅有1例，是将透明 颤菌血红蛋白基因 VHb转入斑马鱼（Guan B et &1.，]&池 ;[(^6(3111101，2011，13:336-344)。究 其原因，主要是我们目前对鱼类耐低氧性状关联性显著的基因所知太少，无法提供用于基 因操作的候选基因。

　　[0007] 综上所述，亟待有一批鱼类耐低氧基因获得应用，将其转入鱼类基因组后，能够显 著提高鱼类细胞和机体的低氧耐受能力。

　　【发明内容】

　　[0008] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。

　　[0009] 本发明还有一个目的是提供一种具有提高鱼类低氧耐受能力功能的核苷酸序列， 将其作为转植基因整合进入受体鱼类基因组，并有效表达后，能够显著提升受体鱼细胞和 机体的低氧耐受能力。

　　[0010]为此，本发明提供的技术方案为：

　　[0011] -种具有提高鱼类低氧耐受能力功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列 如(a)或(b)或(c)或(d)所示：

　　[0012] (a)如SEQ ID N0:1 所示；

　　[0013] (b)如SEQ ID N0:2所示；

　　[0014] (c)编码如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

　　[0015] (d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码巯基特异性抗氧 化蛋白的核苷酸序列。

　　[0016] -种具有提尚鱼类低氧耐受能力功能的蛋白质，其氣基酸序列如SEQ ID N0: 3所 不。

　　[0017] -种重组载体，所述重组载体含有所述的核苷酸序列和与所述核苷酸序列可操作 地连接的用于表达的调节序列。

　　[0018] 优选的是，所述的重组载体中，所述重组载体为含有所述的核苷酸序列的表达载 体。

　　[0019] 宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的核苷酸序列或所述的重组载体。

　　[0020] -种获得所述的重组载体的方法，包括如下步骤：

　　[0021] 利用限制性内切酶EcoRI和Bgl II双酶切如包含Prdx核苷酸序列的全长CDNA克 隆，同时利用限制性内切酶EcoRI和BamHI将pTol2-Neo质粒双酶切，之后将双酶切后的Prdx 核苷酸序列和pT〇12-Ne〇质粒进行连接，通过筛选得到含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列 的pTol2-Prdx_Neo重组载体。

　　[0022] 一种获得所述的宿主细胞的方法，包括如下步骤:将获得的pTol2-Prdx-Neo重组 载体转染入草鱼肾脏细胞系Ctenopharyngodon idellus kidney。

　　[0023] 一种提高鱼类低氧耐受能力的方法，包括如下步骤：

　　[0024] a.提供所述的宿主细胞;和，

　　[0025] b.将所述宿主细胞整合入鱼类中，得到低氧耐受能力提高的鱼类。

　　[0026] 所述的核苷酸序列、所述的蛋白质、所述的重组载体或所述的宿主细胞用于提高 鱼类低氧耐受能力和耐低氧转基因鱼品种培育中的的用途。

　　[0027]本发明至少包括以下有益效果：

　　[0028]本发明的耐低氧基因可应用于耐低氧转基因鱼品种培育，通过合适的转基因手段 将Prdx基因转植进入原本不耐低氧的鱼类基因组内，并使其有效表达，可以大幅增加鱼类 细胞内的抗氧化蛋白表达量，抵抗低氧胁迫下细胞内生成活性氧分子引起的组织损伤和细 胞凋亡，从而显著提高细胞及个体的低氧耐受能力，培育适宜节水低碳养殖模式的耐低氧 鱼类新品种。

　　[0029] 本发明的耐低氧基因来源于鲤鱼，其核酸序列及转录、翻译产物均在鱼类体内天 然存在，用作鱼类转基因操作中的转植基因可以形成"全鱼"转基因产品，避免消费者的食 用安全和生物伦理顾虑，有利于转基因产品的推广。

　　[0030] 本发明的Prdx基因编码巯基特异性抗氧化蛋白的鱼类基因，能够协助抵御氧活性 物质带来的细胞和组织损伤，提高低氧存活率，可应用于耐低氧转基因鱼品种培育。

　　[0031] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

　　【附图说明】

　　[0032] 图1为本发明中鲤鱼低氧耐受性状GWAS分析的曼哈顿图；

　　[0033]图2为本发明中低氧耐受性状显著性关联位点精细定位图，其中，Carp0001519(p = 5.28*10-8)为显著性关联位点，Carp0188137(p = 7.04*10-7)和 Carp0195197(p = 9.78*10 7)为提不性关联位点；

　　[0034]图3为本发明中低氧耐受性状显著性关联基因组区域候选基因表达量对比图，其 中，横条表示低氧敏感品种荷包红鲤中的候选基因表达量，网格表示低氧耐受品种镜鲤中 的候选基因表达量；

　　[0035]图4为本发明中耐低氧基因 Prdx在脑、肝脏、头肾、鳃、血液和肌肉6种组织内的表 达量图，其中，横条表示低氧敏感品种荷包红鲤中的候选基因表达量，网格表示低氧耐受品 种镜鲤中的候选基因表达量，*表示统计学意义的差异显著(P〈〇.05)，**表示统计学意义的 差异极显著(P〈〇.〇l);

　　[0036] 图5为本发明中转基因载体pTol2-Prdx_Neo的结构图；

　　[0037]图6为本发明中转Prdx基因鱼类细胞系在低氧和氧活性分子分别处理48h后的存 活率对照图，其中，**表示统计学意义的差异极显著(p〈〇.01)。

　　【具体实施方式】

　　[0038]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。

　　[0039]应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。

　　[0040] 本发明中，SEQ ID NO: 1表示鲤鱼(Cyprinus carpio)耐低氧基因 Prdx的全长cDNA 序列，其中51-539位的碱基序列为该基因的编码区（coding sequence，Q)S)，如SEQ ID NO: 2所示，SEQ ID N0:3表示该基因编码的、分子量约为17.3kDa、具有过氧化物酶活性的蛋白 质的氨基酸序列。

　　[0041 ] 细胞内低氧能够引起线粒体电子传递链(electron transport chain，ETC)紊乱， 生成氧活性分子(reactive oxygen species，R0S)，这些R0S释放到细胞质中，激活氧化信 号通路，就会诱发氧化应激、DNA损伤进而导致细胞凋亡和组织损伤（Clanton T.L.， Journal of Applied Physiology,2007,1024,2379-2388；Sabharwal S.S.&Schumacker P.T.，Nature Review Cancer，2014，14,709_721)。动物体内的多种氧化还原蛋白具有过氧 化物酶活性，能够调节细胞内ROS浓度，并通过调控蛋白激酶等信号分子的氧化还原状态， 参与细胞内信号转导过程，帮助组织和机体抵御低氧损伤。本发明提供的耐低氧基因 Prdx 就是通过该途径发挥作用，从而提升鱼类耐低氧性状的。

　　[0042] 本发明提供的耐低氧基因 Prdx来源于鲤鱼，是应用鲤鱼250K高通量分型芯片，检 测了低氧耐受鲤鱼品种镜鲤，和低氧敏感鲤鱼品种荷包红鲤的F10代杂交后裔1243尾个体， 并开展低氧耐受性状全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)而筛选 出的。通过GWAS分析，获得了一组紧密连锁的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Po 1 ymorph i sm，SNP)位点，与低氧耐受性状显著关联，随后定位到该组SNP位点的效应基因 为Prdx，该基因产物是一种巯基特异性抗氧化蛋白，在耐低氧个体中表达量显著高于不耐 低氧个体。

　　[0043] 本发明提供一种具有提高鱼类低氧耐受能力功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列 的碱基序列如(a)或(b)或(c)或(d)所示：

　　[0044] (a)如SEQ ID N0:1 所示；

　　[0045] (b)如SEQ ID N0:2所示；

　　[0046] (c)编码如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

　　[0047] (d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码巯基特异性抗氧 化蛋白的核苷酸序列。

　　[0048]本发明还提供一种具有提尚鱼类低氧耐受能力功能的蛋白质，其氣基酸序列如 SEQIDN0:3**。

　　[0049] 本发明还提供一种重组载体，所述重组载体含有所述的核苷酸序列和与所述核苷 酸序列可操作地连接的用于表达的调节序列。

　　[0050] 在本发明的其中一个实施例中，所述的重组载体中，所述重组载体为含有所述的 核苷酸序列的表达载体。

　　[0051] 本发明还提供宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的核苷酸序列或所述的重组载 体。

　　[0052]本发明还提供一种获得所述的重组载体的方法，包括如下步骤：

　　[0053] 利用限制性内切酶EcoRI和Bgl II双酶切包含Prdx核苷酸序列的全长cDNA克隆， 同时利用限制性内切酶EcoRI和BamHI将pTol2-Neo质粒双酶切，之后将双酶切后的Prdx核 苷酸序列和pT〇12-Ne〇质粒进行连接，通过筛选得到含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的 pTo 12-Prdx-Neo 重组载体。

　　[0054]本发明还提供一种获得所述的宿主细胞的方法，包括如下步骤:将获得的pT〇12-Prdx-Neo重组载体转染入草鱼肾脏细胞系Ctenopharyngodon idellus kidney。

　　[0055]本发明还提供一种提高鱼类低氧耐受能力的方法，包括如下步骤：

　　[0056] a.提供所述的宿主细胞;和，

　　[0057] b.将所述宿主细胞整合入鱼类中，得到低氧耐受能力提高的鱼类。

　　[0058]所述的核苷酸序列、所述的蛋白质、所述的重组载体或所述的宿主细胞用于提高 鱼类低氧耐受能力和耐低氧转基因鱼品种培育中的的用途。

　　[0059] 实施例1

　　[0060] 1.鲤鱼低氧耐受性状的GWAS分析

　　[0061]鲤鱼不同品种和地理群体间的低氧耐受性状差异显著。选取低氧耐受品种镜鲤与 低氧敏感品种荷包红鲤的F10代杂交后裔作为实验群体，实验个体同池饲养至3月龄，移入 室内暂养缸中，25°C暂养7d使之适应环境，选取无外伤、无感染、正常游泳和摄食的个体用 于低氧实验。气栗充氧，控制溶解氧浓度在6. Omg/L以上，禁食24h后停止充氧，使溶解氧浓 度持续自然下降，个体陆续缺氧昏迷时逐一采集静脉血样本。实验个体平均体质量为1〇7± 20g，共采集1243尾有效个体样本。

　　[0062]血液样本按体积比1:9加入裂解液中，65°C裂解过夜后常温保存。裂解液配方为： 100mM NaCL，10mM Tris盐酸，25mM EDTA，0.5%SDS，使用灭菌去离子水配制，调节pH值至 8.0〇

　　[0063] 使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根DP324-03)提取基因组DNA，挑选电泳条 带清晰无拖尾、A260/280在1.8至2.0之间、浓度大于lOOng/yL的极端性状(5% )个体DNA样 本共96个，使用鲤鱼250K高通量SNP芯片(Affymetrix Carp Array)进行分型检测。分型数 据质控标准设置为DQC彡0.85，QC Call Rate彡97，Plate QC Percent彡95，Plate QC Average Call Rate多97,通过质控的样本共93个，包括低氧耐受样本48个，低氧敏感样本 45个。

　　[0064] 使用PLINK软件进行鲤鱼低氧耐受性状GWAS分析，设置MAF为0.05，HWE为0.0001， GEN0为0.05，显著性关联位点标准为p〈10-7(FDR〈0.001)，提示性关联位点标准为p〈10- 5 (!^1?〈0.05)。关联分析结果见图1，包括显著性关联位点1个(0&印0001519)，提示性关联位 点30个，其中1个显著性关联位点与15个提示性关联位点成簇分布，均位于42号连锁群 (linkage group 42，LG42)上，表明该基因组区域存在与低氧耐受性状密切关联的基因型。 [0065] 2.鲤鱼低氧耐受关联位点Carp0001519的效应基因精细定位

　　[0066] GWAS分析获得的低氧耐受显著性关联位点Carp0001519探针碱基序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:4序列第36位发生A/G转换突变，GG与GA基因型为低氧耐受表型，而AA 基因型对应低氧敏感表型。Carp0001519位点为鲤鱼核RNA输出因子(nuclear RNA export factor 1，Nxfl)外显子上的同义突变，不引起编码蛋白质的序列改变，因而该位点的实际 效应位点位于与之连锁的其它基因座位。

　　[0067]通过筛查GWAS结果中的提示性关联位点，发现与Carp0001519距离最近的提示性 关联位点为Carp0188137和Carp0195197,并分别位于ΝχΠ 基因的5'与3'侧，提示效应基因 处于Carp0188137与Carp0195197之间的基因组区域。通过与斑马鱼蛋白质数据库进行 BLASTx序列比对，注释候选基因组区域，结果如图2所示，Carp0001519侧翼100kb基因组区 域内共包含9个蛋白质编码基因。

　　[0068]使用BWA软件，在镜鲤与荷包红鲤转录组数据库中对9个候选效应基因开展表达量 分析，依据公式 RPKM = total exon reads/[mapped reads (mi 11 ions )*exon lenth(kb)]， 分别计算9个候选基因 RPKM表达量值，结果如图3所示，Prdx基因在低氧耐受品种镜鲤中的 表达量大幅尚于低氧敏感品种荷包红趣，而其余8个基因表达量在品种间无明显差异，提不 效应位点通过调节Prdx基因表达量来影响鱼类低氧耐受性状，Prdx为该位点的效应基因。 [0069] 3.鲤鱼耐低氧基因 Prdx的表达模式分析

　　[0070] 3.1样本采集

　　[0071]选取3月龄镜鲤、荷包红鲤各5尾用于组织样本总RNA提取，个体选择标准为健康、 正常摄食、体质量相近。每尾个体采集脑、肝脏、头肾、鳃、血液、肌肉组织约l〇〇mg，分别保存 于lmL RNAlater(Life technologies)中，4°C过夜使试剂充分浸润后，常温保存。

　　[0072] 3.2鲤鱼组织样品总RNA提取

　　[0073]所有金属实验器具包括剪刀、镊子、匀浆珠等预先200°C烘烤6h，塑料制品包括离 心管、枪头等预先用〇. 1 %DEPC水浸泡过夜，然后高压蒸汽灭菌，将灭菌的塑料制品于60°C 烘箱中烘烤干燥。所有溶液使用DEPC处理过的水配制。

　　[0074] 使用TRIzol试剂（Life technologies)分别提取各样品总RNA，具体操作步骤如 下：

　　[0075] (1)切取约5Omg组织样品，移入预置lm 1 TRI ζο 1的2m 1无 RNA酶的离心管中，使用 Tissuelyzer 研磨器（Qiagen)破碎组织，30fr/min，3mins;

　　[0076] (2)将组织破碎后的样品室温放置5mins，使核蛋白质彻底裂解；

　　[0077] (3)每管样品加入200μ1氯仿，剧烈振荡30s，冰上放置5mins，12000g、4°C离心 15mins，离心后，混合物分为淡红色的酚仿相、中间相和无色的上层水相；

　　[0078] (3)将包含RNA的水相溶液转移至新离心管中，加0.5mL(等体积)的异丙醇，上下颠 倒数次混勾，室温放置15mins，12000g、4°C离心10mins，可见RNA沉淀；

　　[0079] (4)弃上清，用微量移液枪吸干管口余液，用70 %乙醇洗涤，加入700yL无水乙醇， 震荡漂洗RNA沉淀，8000g、4°C离心10mins;

　　[0080] (5)RNA沉淀真空浓缩干燥3mins，加30yL无 RNA酶的水溶解，-80°c保存。

　　[0081 ] 3.3总RNA纯度和质量检测

　　[0082] 取2yL RNA提取物，10倍稀释。紫外分光光度计测定0D260/0D280值，0D260/0D280 值在1.8-2.0之间，表明所提取的RNA纯度较高。1 %琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28S条带清 晰，且后者亮度约为前者的2倍，表明总RNA完整性良好。

　　[0083] 3.4第一链〇0嫩的合成

　　[0084] 使用First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-a-RT-PCR试剂盒 (Τ0Υ0Β0)进行mRNA反转录。

　　[0085] 向200yL无 RNA酶的微量离心管中加入各组分，冰上操作，反应体系如下：

　　[0086] Total RNA lyg

　　[0087] 01ig〇(dT)(10yM) lyL

　　[0088] RNase Free H20 10yL

　　[0089] 65°C，5mins后，立即置于冰上。 5xRT Buffer 4|iL. dNTP Mixture (fl- lOmM) 2

　　[0090] RNase Inhibitor (10 U/μΙ) 1 jiL ReverTra Acc IpL 体系总体积 20μΙ_.

　　[0091 ]反应程序：3CTC、lOmins，42°C、20mins，99°C、5mins，4°C、5mins，瞬时离心。

　　[0092] 3·5实时焚光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT_PCR)检测Prdx基因表 达模式

　　[0093] 使用SYBR Green RT-PCR试剂盒（Τ0Υ0Β0)，在AB 7500 real-time PCR系统（Life 七6(：111]1〇1(^丨68)上进行91?1'-?0?实验分析?1(^基因在低氧耐受品种镜鲤和低氧敏感品种荷 包红鲤中的表达模式。使用β-actin作为内参基因，2-Δ Act法计算基因相对表达量。

　　[0094] Prdx扩增引物

　　[0095] Prdx-F：TGGATGAGGTCGCATGTGTG；(SEQ ID NO：5)

　　[0096] Prdx-R：CAGGCTCGACACTGAGCTTC〇(SEQ ID N0：6)

　　[0097] β-actin 扩增引物

　　[0098] ACT-F：TGCAAAGCCGGATTCGCTGG；(SEQ ID NO：7)

　　[0099] ACT-R：AGTTGGTGACAATACCGTGC〇(SEQ ID N0：8)

　　[0100] 反应体系如下： ddH-? 4 pL SYBR?Grccn Realtime PCR Master Mix ?0μL Forward Primer( 1Q. .μΜ) 0,5 μ!>

　　[0101] Reverse Primcr( 10 μΜ) 0,5 μL eDNA 5 pL 体系总体积 2〇nL

　　[0102] 反应程序：50。(：、211^118,95。(：、1011^118;95。(：、158,60。(：、111^1140循环。

　　[0103] 结果如图4所示，Prdx基因在镜鲤脑、肝脏、头肾中的表达量均高于荷包红鲤，差异 极显著，差值在2倍以上，证实该基因为低氧耐受相关基因，主要在脑、肝脏、头肾中发挥组 织保护作用。

　　[0104] 4.鲤鱼耐低氧基因 Prdx的转基因载体构建

　　[0105]从鲤全长eDNA文库中挑取包含Prdx基因的克隆，接种于含50ng/L卡那霉素的LB液 体培养基内，37 °C过夜培养，收集菌体，碱裂解法提取质粒，灭菌水溶解。使用EcoRI (NEB)和 Bgl II(NEB)，37°C双酶切8h，反应体系如下： ddH Ο 22p.L 1 OX NEB Buffer 3,1 5 pL EcoR 1(20 U) 2 μι

　　[0106] 11(10 U) 1 μΤ, /?&质粒 DNA pL 体系总体积 5〇μL

　　[0107] 反应结束后加入EDTA至终浓度20mM使内切酶失活，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回 收l.lkb基因片段。

　　[0108] 取10yL载有pT〇12-Ne〇质粒的DH10B菌液，接种于含50ng/L卡那霉素的LB液体培养 基内，37°C过夜培养，收集菌体，碱裂解法提取质粒，灭菌水溶解。使用EcoRI (NEB)和BamH I (NEB)，37°C双酶切8h，反应体系如下： ddHiQ 22 μL 10Χ NEB Buffer 3.1 5 t.iL &'oR 丨（20 U) 2 μΕ

　　[0109] BamW 1(10 U) 1 μL pTol2-Neo 质粒 DNA 20 tuL 体系总体积 50 [iL

　　[0110] 反应结束后，加入EDTA至终浓度20mM使内切酶失活，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测， 回收8.1kb载体片段。

　　[0111] 使用T4DNA连接酶(NEB)连接基因片段和载体片段，16°C连接8h，反应体系如下： ddH20 3.uL 10X T4 DNA Ligase BuiTcr 1.5 μL T4 DNA连接酶 0 5 μL

　　[0112] 一 1?&基因酬A pTol2-Neo 载体 DNA 5 ^iL 体系总体积 15μL

　　[0113] 反应结束后，65°C热处理lOmins使酶失活，将连接产物加入100yL感受态细胞悬 液，轻柔混勾，冰上静置20mins，42°C水浴热激90s，迅速移至冰上3mins。加入lmL不含抗生 素的LB液体培养基，混匀后37 °C振荡培养lh，待细菌恢复正常生长状态后，涂布含50ng/L卡 那霉素的LB固体培养基，37 °C培养24h。

　　[0114] 挑取单克隆扩大培养，碱裂解法提取质粒DNA，测序鉴定，测序引物为pTol-F: CGATTAGCGTAACGAGCTAG(SEQIDN0 :9)。成功插入SEQIDN0:1序列者即包含构建成功的 pTol2-Prdx_Neo 载体。

　　[0115] 5.鲤鱼耐低氧基因 Prdx的转基因细胞系构建

　　[0116]使用pTol2-Prdx_Neo载体转染草鱼肾脏细胞系（Ctenopharyngodon idel lus kidney，CIK)，构建核基因组内成功插入Prdx基因序列的转基因细胞系，插入片段中同时包 含报告基因 Neo,可使用抗生素 G418筛选外源片段插入成功的细胞。具体操作步骤如下：

　　[0117] (1)碱裂解法提取pT〇12-PrdX-Ne〇载体质粒，用无 RNA酶的水溶解为500ngAiL浓度 备用；

　　[0118] (2)使用Not I(NEB)对质粒pCST〇12进行酶切，使其线性化，使用mRNA体外合成试 剂盒(mMESSAGEmMACH丨NE.j?SP6Kit，Ambion)体外转录合成Tol2转座酶mRNA，用无 RNA酶 的水溶解为500ng/yL浓度备用；

　　[0119] (3)转染前24h，将CIK细胞移入6孔板，使之呈单细胞分散状态，每孔加入3mL含 10 %小牛血清的MEM培养液。细胞传代约24h，每孔中的细胞量达到60 % -70 %左右时进行转 染；

　　[0120] (4)用无血清的MEM培养基配制转染溶液，涡旋混匀后室温静置20min，加入细胞培 养孔，使每孔中加入2yg pTol2-Prdx-Neo质粒，1.5yg Tol2转座酶mRNA，和7yL转染剂 Lipofectamine 2000,轻轻摇动平皿混匀，放入5%C02的25°C温箱中培养；

　　[0121] (5)转染后4h换半液，使用含10%小牛血清的MEM培养基；

　　[0122] (6)转染后24h按1:4比例稀释传代至24孔板，使用含600yg/mL G418，10%小牛血 清的MEM培养液；

　　[0123] (7)稳定培养2周后，使用胰蛋白酶消化细胞，移入细胞培养瓶中扩大培养，使用含 300yg/mL G418，10 %小牛血清的MEM培养液；

　　[0124] ( 8 )提取基因组DNA，PCR扩增产物测序鉴定，扩增引物为pTol-F : CGATTAGCGTAACGAGCTAG(SEQ ID N0：9),pTol-R：GCACAGTGAGCAGACACAAA(SEQ ID NO：10), 扩增片段长度为3251bp，测序引物为pTol-F，测序结果中包SEQ ID N0.1序列者即为成功转 入Prdx基因的细胞系。

　　[0125] 按以上同样步骤构建转入pT〇12-Ne〇对照空载体的转基因细胞系，细胞系鉴定时 扩增引物同为pTol-F和pTol-R，扩增片段长度为2749bp。

　　[0126] 6.转Prdx基因细胞系的低氧耐受性状测定

　　[0127] 6.1测定转Prdx基因细胞系在低氧培养条件下的存活率

　　[0128] 实验使用24孔板，转Prdx基因细胞、转空载体细胞、无转染普通CIK细胞各8孔，每 孔加入lmL含10 %小牛血清的MEM培养液，在25 °C条件下常氧培养24h，培养箱中气体含量为 5 % C02、20 % 〇2、75 % N2 和其他气体。

　　[0129] 培养箱中气体含量改为5^^02、5%02、90%犯和其他气体，低氧处理4811后计数各 孔中细胞。

　　[0130] 按照公式:细胞存活率=转基因细胞数/CIK细胞数*100%，计算转Prdx基因细胞 和转空载体对照细胞各自的低氧存活率，结果如图6所示，转Prdx基因的CIK细胞低氧耐受 能力比转空载体对照组提高了 57%。

　　[0131] 6.2测定转Prdx基因细胞系在R0S胁迫下的存活率

　　[0132] 实验使用24孔板，转Prdx基因细胞、转空载体细胞、无转染普通CIK细胞各8孔，每 孔加入lmL含10 %小牛血清的MEM培养液，在25 °C条件下常氧培养24h，培养箱中气体含量为 5 % C02、20 % 〇2、75 % N2 和其他气体。

　　[0133] 培养液换半液，新换培养液为含0.2mM H2〇2、10 %小牛血清的MEM培养液，常氧培 养，每隔12h换半液，新换培养液为含0.2mM H2〇2、10%小牛血清的MEM培养液，48h后计数各 孔中细胞。

　　[0134] 按照公式:细胞存活率=转基因细胞数/CIK细胞数*100%，计算转Prdx基因细胞 和转空载体对照细胞各自的R0S胁迫存活率，结果如图6所示，转Prdx基因的CIK细胞抵御 R0S损伤能力比转空载体对照组提高了105%。

　　[0135] 这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的Prdx基 因的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

　　[0136] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。

　　【主权项】

　　1. 一种具有提高鱼类低氧耐受能力功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如 (a)或(b)或(c)或(d)所示： (a) 如SEQ ID N0:1 所示； (b) 如SEQ ID N0:2所示； (c) 编码如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d) 在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码巯基特异性抗氧化蛋 白的核苷酸序列。2. -种具有提尚鱼类低氧耐受能力功能的蛋白质，其氣基酸序列如SEQ ID N0:3所不。3. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的核苷酸序列和与所 述核苷酸序列可操作地连接的用于表达的调节序列。4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为含有权利要求1所述的 核苷酸序列的表达载体。5. 宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1所述的核苷酸序列、或权利要 求3或4所述的重组载体。6. -种获得如权利要求4所述的重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤： 利用限制性内切酶EcoRI和Bgl II双酶切包含Prdx核苷酸序列的全长cDNA克隆，同时 利用限制性内切酶EcoRI和BamH I将pT〇12-Ne〇质粒双酶切，之后将双酶切后的Prdx核苷酸 序列和pTol2-Neo质粒进行连接，通过筛选得到含有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的 pTo 12-Prdx-Neo 重组载体。7. -种获得如权利要求5所述的宿主细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:将权利 要求6获得的pTol2-Prdx_Neo重组载体转染入草鱼肾脏细胞系Ctenopharyngodon idellus kidney〇8. -种提高鱼类低氧耐受能力的方法，其特征在于，包括如下步骤： a. 提供权利要求5所述的宿主细胞;和， b. 将所述宿主细胞整合入鱼类中，得到低氧耐受能力提高的鱼类。9. 权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的蛋白质、权利要求3或4所述的重组 载体或权利要求5所述的宿主细胞用于提高鱼类低氧耐受能力和耐低氧转基因鱼品种培育 中的用途。

　　【文档编号】C12N15/85GK105969745SQ201610342038

　　【公开日】2016年9月28日

　　【申请日】2016年5月20日

　　【发明人】赵紫霞, 徐鹏, 张研, 江炎亮, 李尚琪, 孙晓晴

　　【申请人】中国水产科学研究院