世界上为什么会有纳米抗体？
关于什么是纳米抗体，纳米抗体的特征和优势，纳米抗体在各个领域的应用，相信很多小伙伴都早已了然于胸。但是，纳米抗体为什么会出现在羊驼、美洲驼、双峰驼等骆驼科动物中？纳米抗体是怎样形成的，其背后的分子机制又是怎样的呢？本文将就此问题进行探讨。
1.HCAbs的发现及起源
1989年比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家Hamers-Casterman等纯化骆驼血清时，在protein G和protein A不同洗脱条件下意外地实现了传统抗体和重链抗体（Heavy-chain antibodies ，HCAbs）的分离，发现轻链缺失的HCAbs，其可变区即是纳米抗体（亦称为nanobody或VHH），图1。
图1. 骆驼血清纯化及电泳分析：protein G上pH3.5洗脱物（lane1）、protein A上pH4.5洗脱物（lane3）即为重链抗体（HCAbs）
高等脊椎动物中只有骆驼科存在HCAbs，骆驼科属于偶蹄目。站在进化论的角度来看问题，偶蹄目源自5000万年前始新世的踝节目，已演化成为哺乳类中最繁盛的家族之一，现存300余种，可分4个亚目：胼足亚目（骆驼和羊驼类）、猪形亚目（猪和西猯）、反刍亚目（牛、羊、鹿等）、鲸河马亚目（鲸豚类与河马）。猪形亚目、反刍亚目、鲸河马亚目中并没有出现HCAbs；所以HCAbs出现的时间最早可追溯到偶蹄目到胼足亚目演化的过程中，最晚出现在骆驼和羊驼物种形成之前。
2.探索骆驼基因组中的γ2a基因
在没有轻链（L链）的情况下，正常的抗体重链（H链）会被内质网中重链结合蛋白（H-chain binding protein，BiP）滞留，在细胞内部被降解而不能向胞外分泌。BiP和L链与H链的结合位点几乎相同，当抗体CH1缺失导致L链结合位点的消除同时，BiP滞留的调节机制也同时失效，这使得缺失CH1的重链能够形成同源二聚体并向细胞外分泌，可见拥有去除CH1典型结构的机制是形成重链抗体HCAbs的关键步骤。
那么骆驼科HCAbs的CH1是怎么去除的呢？还是它原来本就没有CH1，如果有后来又去哪里了？很显然直接对骆驼科抗体基因进行测序，从分子的角度来看问题是最直接有效的方法。
哺乳动物抗体重链可分为五类，以希腊字母γ、α、μ、δ、和ε表示，分别对应IgG、 IgA、 IgM、IgD和IgE。IgG是血清中含量最多和研究最为广泛的抗体亚型，产生纳米抗体的HCAbs也属于IgG。如何从浩瀚的基因组DNA中找到重链抗体IgG基因序列呢？Hamers-Casterman团队在发现纳米抗体后并没有停止探索的脚步，其团队的Raymond Hamers和Serge Muyldermans等从骆驼的肝脏组织中提取基因组DNA，酶切消化后构建噬菌体基因组文库，采用噬菌斑原位杂交（in situ plaque hybridization）技术，用cDNA γ2a探针经过3轮筛选得到了骆驼重链抗体γ2a基因（ACC No. AJ131945）。
3.纳米抗体形成的分子机制
对骆驼重链抗体γ2a基因进行分析，比较骆驼γ2a基因和哺乳动物（人、小鼠、大鼠、兔和牛）Cγ基因的外显子和内含子的长度（表1）；可见除了非编码区和铰链区长度的一些变化外，骆驼γ2a外显子的长度非常保守，显然骆驼的γ2a是典型的哺乳动物IgG结构。
表1 哺乳动物IgG外显子和IVS（内含子或间隔序列）长度比较
进一步分析发现，γ2a的CH1、CH2、CH3、H（铰链）、M1和M2分别存在于分开的外显子中（其外显子和内含子的主要特征是通过与其他哺乳动物IgG基因的类比来确定的），见图2；需要注意的是γ2a基因组中是存在CH1外显子部分的，但是在cDNA中CH1部分已经缺失，这说明CH1部分的缺失可能发生在基因转录到cDNA生成的过程中。与其它哺乳动物相比较，骆驼的CH1、CH2、CH3基因与人和牛的基因同源性较高（70-76%），骆驼CH1区域不包含核苷酸的插入、缺失或终止密码子，但是在骆驼CH1的nt566(图2）位置存在G to C突变，这导致CH1此处的Cys208突变成了Ser208。Cys208在IgG内部折叠过程中形成二硫键，作者分析认为这影响了IgG折叠的稳定，导致CH1突变后难以形成正常的IgG，这可能是CH1部分基因的沉默原因之一。
图2 图中外显子均用方框圈出，其余为内含子；CH1、CH2、CH3分别代表抗体重链恒定区；H代表抗体铰链区；M1和M2代表重链与跨膜和胞质区域。
事实上，在人和老鼠中就存在一种重链疾病(Morrison, 1978; Khamlichi et al., 1995;Brandt et al., 1984)，表现为抗体CH1的mRNA异常剪切而完全或部分缺失，这种情况与骆驼惊人的相似。那么骆驼的CH1部分是不是mRNA剪切异常导致，Raymond Hamers和Serge Muyldermans等将已知哺乳动物外显子和内含子边界序列进行比对（图3），发现在CH1和IVS1（内含子或间隔序列）交界附近，骆驼γ2a基因相较于典型的IgG存在多个碱基的突变，其中的IVS1第1位G to A突变打破了适用于几乎所有真核基因的GT/AG mRNA处理规则，CH1外显子因此被mRNA剪切丢失，而形成无法与轻链结合的重链抗体HCAbs。
图3 骆驼γ2a基因CH1外显子3’附近序列与其他IgG比较
综上，骆驼科动物因为重链抗体γ2a基因CH1的nt566位置G to C突变，难以形成正常的IgG；CH1和IVS1交界附近的多个碱基的突变，特别是IVS1第1位G to A突变打破了适用于几乎所有真核基因的GT/AG mRNA处理规则，导致mRNA剪切时CH1部分外显子被剪切掉；失去了CH1部分的重链因没有轻链结合位点，在进化过程中获得了独自与抗原结合能力，形成重链抗体HCAbs，纳米抗体由此而生。
文献参考：
1.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.
2.Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire CH1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies.
3.Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae.