不均匀、易脱片…...如何不用爬片直接做免疫荧光？

　　师弟

　　师姐，我新染的免疫荧光片子，为什么外圈细胞比内圈的要亮呢？

　　你这细胞密度过高都连成片了，爬片做的也不好，加上染料接触细胞的面积也不同，就会出现这样的结果。

　　师姐

　　师弟

　　啊，密度太高吗？之前我掉片儿也是密度太高导致的……

　　对啊！还有你之前忘记把玻片密封好，玻片接触空气湿度大黏连了很难分开，罚你这周刷瓶子！

　　师姐

　　师弟

　　呜呜呜好的……要是培养皿里能直接做细胞免疫荧光就好了

　　免疫荧光技术应用广泛，不过传统的免疫荧光实验经常会遇到爬片效果欠佳、染液分布不均以及操作繁琐，费时费力等难题。

　　不要怕，今天给大家送上一体化的「培养室-固定-染色-成像」免疫荧光解决方案！

　　Ibidi 一体化免疫荧光染色载玻片

　　无需包被爬片，快速染色无渗漏

　　节省试剂与细胞

　　

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　　一体化免疫荧光有什么优势？

　　无需包被爬片，一个盒子搞定全部实验

　　一体化免疫荧光含有 8/18 个独立的开放小室，「All-in-one」小室可以直接用来做细胞培养和显微观察。这种腔式载玻片/培养皿，不需要包被，不需要爬片。

　　培养细胞－冲洗玻片－固定细胞－染色－成像，所有步骤都在这个载玻片就可以完成。

　　光学效果极佳，适合各种显微镜

　　No.1.5 聚合物盖玻片底部非常适合进行高分辨率成像，具有极佳光学效果，适用于各种显微镜技术（如 DIC、宽场荧光、共聚焦显微镜、双光子显微镜、FRAP、FRET、FLIM 和 LSFM）。

　　以下是今年发表在《Cell Biology and Disease》杂志的文章，使用一体化免疫荧光技术对 U2OS 细胞进行的染色图片，质量高、清晰美观，助力高质量论文发表[1]。

　　

　　还有最重要的一点，价格经济实惠，仅需少量的细胞和试剂就能出结果，可以帮大家节省大量科研经费。

　　Ibidi 一体化免疫荧光如何操作？

　　下面介绍一个使用 ibidi μ-Slide 8/18 孔载玻片培养和染色贴壁细胞的详细实验方案。

　　培养大鼠成纤维细胞，用多聚甲醛固定，再用线粒体染料 MitoTrackerDAPI 对细胞核进行复染。最后经过一抗和二抗染色，通过免疫细胞化学探测其他细胞内结构。

　　该应用包括四个主要步骤：

　　

　　在我们的示例中，我们使用了以下材料：

　　? Rat fibroblasts（cell line）

　　? μ-Slide 8 well，ibiTreat（ibidi，80826）

　　? Paraformaldehyde（2% in PBS）

　　? Triton? X-100（Fluka，0.1%）

　　? Blocking solution（1% BSA in PBS）

　　? MitoTracker Green（Life Technologies，50 nM)

　　? DAPI（Sigma，0.1 μg/mL）

　　荧光显微镜（倒置），带有适当的滤光片组。

　　1

　　培养

　　在无菌条件下打开 ibidiμ-Slide 8 孔载玻片 ibiTreat（80826），将其放在 μ-Slide Rack（80003）或适当的平面上。准备细胞悬液（5 x 104 细胞/ mL），并在 μ-Slide 8 孔载玻片每个孔中加入 300 μL 盖上盖子。 将载玻片放入培养箱（37°C；5 ％CO2）中，让细胞附着。培养至少 3 小时或过夜。Tip：对于更长的细胞培养，建议几天后进行对细胞进行换液。

　　

　　2

　　固定，渗透和封闭

　　使用细胞培养抽吸装置从孔中吸出细胞培养基，将 300 μL 缓慢加入每个孔 Dulbecco PBS 清洗细胞。 用约 150 μL 2％ paraformaldehyde 固定细胞 20 分钟，之后吸出液体并涂抹 150 μL 的0.1％Triton?X-100，10 分钟后吸出液体并用 300 μL BSA 封闭液洗涤细胞。

　　

　　3

　　染色

　　准备染色液和抗体溶液，使用 150 μL DAPI 溶液并在室温下培养 30 分钟，用 300 μL BSA 封闭溶液洗涤细胞两次。使用 150 μL MitoTracker 溶液并培养 45 分钟，用 300 μL BSA 封闭溶液洗涤细胞两次后吸出，再逐滴添加约 150 μL 的 ibidi 安装介质。

　　

　　4

　　成像

　　在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞，并可选择用 ibidi 浸油（＃50101）观察细胞，（可选）覆盖图像以创建合并图像。

　　

　　

　　无需包被爬片，快速染色无渗漏，节省试剂与细胞，加速你的实验进程，助力科研成果快速发表。

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　　内容策划：那雪妍内容审核：朱卿

　　题图来源：图虫创意

　　参考文献：

　　1、Avital Schwed-Gross, Glucocorticoids enhance chemotherapy-driven stress granule assembly and impair granule dynamics, leading to cell death, J Cell Sci, 2022