研发进展：免疫调节抗体偶联技术（IM
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▉ 抗体药物偶联&免疫检查点阻断
抗体药物偶联物(ADC) 和免疫检查点阻断 (ICB) 是治疗癌症的有前景的技术方法。
Fig1 抗体免疫调节剂的靶标 资料来源：Immune modulation for cancer therapy
大多数 ICB 策略通过阻断抑制性受体，如细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4(CTLA-4)程序性细胞死亡 1 (PD-1)，程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1)，和 T 细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的 3 (TIM-3) 来恢复抗肿瘤免疫(Fig1)，迄今为止，阻断 PD-1/PD-L1 相互作用是研究最充分的 ICB 策略之一。（复习CTLA-4与PD-1/PD-L1通路）
Fig2 目前已上市的PD-1/PD-L1抗体药物 资料来源：PD-1/PD-L1 Based Combinational Cancer Therapy: Icing on the Cake
Anti-PD-L1抗体已在多种癌症类型（如肺癌、膀胱癌和三阴性乳腺癌）中得到广泛研究。目前，三种Anti-PD-L1抗体（Atezolizumab、Durvalumab 和 Avelumab）已被批准用于治疗各种恶性肿瘤，包括非小细胞肺癌、尿路上皮癌等（Fig2）。不幸的是anti-PD-1或PD-L1抗体治疗的患者响应率只有20%~30%，原因可能是患者肿瘤细胞表面的PD-1和PD-L1低表达，此外也有研究证明与NK细胞有关[1]，但也有研究表面肿瘤细胞其实大量表达了PD-L1，但癌细胞并没有将PD-L1展示在细胞表面，而是通过外泌体将PD-L1运输到细胞外进而导致耐药 [2]（Fig3）。
Fig 3免疫检查点抑制剂响应者与不响应者的肿瘤微环境区别 资料来源：Immune checkpoint inhibitors: recent progress and potential biomarkers
在前期工作中，作者课题组确定了一种双功能免疫调节剂D18（Fig 4A），在各种鼠肿瘤模型中可显着增加 ICB 药物（例如，抗 PD-1 抗体、抗 PD-L1 抗体和抗 TIM3 抗体）的抗肿瘤活性[3]。从机制上讲，D18通过两个细胞通路来增强 ICB 治疗：
（i）由组蛋白赖氨酸脱甲基酶 5A（KDM5A）介导的 PD-L1 上调
（ii）Toll 样受体 7/8（TLR7/8）的激活信号通路（EC 50：hTLR7 的EC 50分别为 24 nM 和 hTLR8 的 10 nM）
抗体-药物偶联物 (ADC)可通过与靶向肿瘤的单克隆抗体直接偶联，将化疗药物特异性递送至癌细胞。经过数十年的临床前和临床研究，ADC 已成为癌症患者的重要治疗选择。目前有超过 80 种 ADC 处于临床试验阶段，到目前为止已有13款ADC陆续上市， 如下图。（回顾ADC）
▉ ADC HE-S2 的构建
Avelumab（MSB0010718C，商品名 Bavencio）是由默克公司和辉瑞公司开发的人源 IgG1 单克隆抗 PD-L1 抗体。重要的是，Avelumab 与小鼠 PD-L1 发生交叉反应，使其适用于小鼠模型研究和人体临床试验。
作者采用了具有工程化反应性半胱氨酸残基 (THIOMAB) 策略的抗体进行位点特异性缀合。Avelumab 在轻链 V205 位置（Kabat 编号）发生突变，以产生具有两个可接近的游离半胱氨酸的工程化抗 PD-L1 抗体（以下称为抗 PD-L1 THIOMAB，图 4B、C）。作者利用二硫化物接头将D18稳定地输送到肿瘤部位后局部药物释放，ADC 的二硫键在血液中相对稳定。在细胞摄取 ADC 后，连接体可以被细胞内谷胱甘肽 (GSH) (1–10 mM) 和蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 降解。二硫键被切断后接头就会环化，然后通过 1,6-消除以释放未修饰的D18。
Fig4 D18、Anti-PD-L1抗体和Anti-PD-L1 THIOMAB以及ADC HE-S2的结构
▉ ADC HE-S2 的体外表征
首先利用荧光激活细胞分选实验（FACS）验证了ADC HE-S2和anti-PD-L1 THIOMAB一样具有结合和靶向 PD-L1 的能力（Fig 5A）。为了在体外评估抗 PD-L1 THIOMAB 的内化，作者首先用 pHrodo 红色染料标记它，并用 IncuCyte 活细胞分析监测内化，24小时后用ThioMab标记孵育后，细胞内荧光信号在MC38和B16细胞中清楚地观察到。此外与WT细胞相比，Cd274 缺陷型细胞中 THIOMAB 的摄取明显被抑制（Fig 5C）。这些发现表明抗 PD-L1 THIOMAB 能够将化学结合的小分子转运到细胞内部。
Fig 5 ADC HE-S2的体外表征
作者通过测量细胞内 TNF-α 水平来估计 ADC HE-S2的 TLR7/8 激动活性。用ADC HE-S2处理Cd274敲除和野生型DC2.4细胞8小时，流式细胞仪检测细胞内TNF-α水平。ADC HE-S2处理后，野生型细胞中 TNF-α 水平显着升高，而 Cd274 敲除细胞中 TNF-α 水平与对照相似（Fig 5D）。
总之，这些结果证明了 ADC HE-S2 的体外 TLR7/8 激动活性和 PD-L1 特异性结合和内化能力。
▉ ADC HE-S2 的抗肿瘤活性评估
接下来作者评估了 ADC HE-S2在小鼠 MC38 结肠癌和 B16 黑色素瘤模型中抑制肿瘤生长的能力。正如预期的一样，由于协同作用，D18和 avelumab组合的肿瘤抑制活性远优于任一单药。令人惊讶的是，ADC HE-S2的抗肿瘤活性优于 avelumab 和D18的组合（Fig6A）。此外，与联合治疗或D18单药治疗相比，ADC HE-S2显示存活率显着延长（Fig6B）。同样，在鼠 B16 黑色素瘤模型中观察到ADC HE-S2提高的抗肿瘤活性（Fig6C）。
这些实验表明，在产生有效抗肿瘤活性所需的浓度下，ADC HE-S2治疗效果显著，且毒性小，安全性高。
▉ ADC HE-S2 的免疫机制研究
ADC HE-S2在两种不同的小鼠癌症模型中显示出显著的抗肿瘤活性，于是作者想确定潜在的免疫机制。
首先，作者描述了 ADC HE-S2对肿瘤微环境中抗肿瘤 T 细胞反应和细胞群的影响。与联合治疗相比，ADC HE-S2显着增加了肿瘤浸润 CD8 + T 细胞的数量（Fig5A），表现出更显着的 TNF-α 和 CD107a 表达，表明 ADC HE-S2可显着激活并诱导 CD8 + T 细胞毒性淋巴细胞和 CD4 + T的浸润细胞（Fig7 B-D）。
此外，与抗 PD-L1 抗体或D18单药治疗相比，ADC HE-S2显着降低了肿瘤微环境中调节性 T 细胞（CD4 + CD25 + Foxp3 +，Treg）的比例（Fig7E)，表明 ADC HE-S2治疗可以减少 Treg 介导的肿瘤免疫抑制。
总的来说，这些结果表明ADC HE-S2治疗可以通过增加CD8 + T细胞浸润和减少Treg数量来有效促进抗肿瘤免疫反应，从而增强PD-1/PD-L1阻断的治疗效果。
▉ 结论
总之，作者应用传统的 ADC 技术作为“桥梁”，开发了一种新的免疫治疗策略，免疫调节抗体 - 药物偶联物（IM-ADC），涉及免疫检查点抗体和非细胞毒性免疫调节剂的偶联。
作者利用位点特异性结合化学将双功能免疫调节剂D18通过氧化还原敏感的二硫键接头连接到抗 PD-L1 THIOMAB。由此产生的 ADC HE-S2既是一种有效的 PD-L1 阻断剂，也是D18的靶向递送载体。到达肿瘤部位后，ADC HE-S2可以有效地靶向并与 PD-L1 结合，然后 ADC/PD-L1 复合物可以被内化并释放有效载荷D18。免疫调节剂D18激活并诱导多种免疫细胞的浸润，重塑免疫抑制微环境（Fig8）。此外，D18可以上调肿瘤组织中的 PD-L1 水平，可能使肿瘤细胞对 PD-1/PD-L1 阻断疗法更加敏感。
Fig8 ADC HE-S2机制示意图
最后，给大家介绍一下近几年ADC 临床应用以及临床上ADC和免疫检查点联用的情况[4]：
参考文献：
[1] Zhang, Q et.al., 2018. Blockade of the checkpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumor immunity. Nature Immunology
[2] New drugs that unleash the immune system on cancers may backfire, fueling tumor growth.
[3] Wang, L.et al. Enhancing KDM5A and TLR activity improves the response to immune checkpoint blockade. Sci.Transl. Med. 2020.
[4] Coats, S. Antibody-drug conjugates: future directions in clinical and translational strategies to improve the therapeutic index. Clin. Cancer Res. 2019.
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