新冠病毒究竟是如何检测的？

　　这次疫情要想得到有效的控制就得做大量的检测。套用奥运会的标准，我们对检测方法的要求就是更准、更快、更便宜。前几天我看到一条新闻说西班牙的检测机构使用了一批冠状病毒检测试剂盒，这批产品应该是实现了更快和更便宜的目标，可是准确率不到30%，引发了很大的争论。

　　https://www.euractiv.com/section/coronavirus/news/spain-returns-faulty-test-kits-to-china-as-covid-19-death-toll-passes-4000-mark/

　　另外，我们还经常看到一些新冠病毒检测出现假阳性， 单阳性和双阳性的新闻。带着这些疑惑，我给大家介绍一下新冠病毒的检测方法，看看这些试剂盒里面都有些什么，他们是怎么工作的。

　　作者：老晋荷兰格罗宁根大学生化博士摄影爱好者，优质文艺宝藏男1. 检测病毒都有什么方法？

　　跟细菌相比，病毒没法直接观察到。细菌可以通过染色在光学显微镜下看到，可是病毒颗粒非常小，尺寸在100纳米（1纳米=10的负9次方米）级别，只能用低温电子显微镜（Cryo-EM）观测到。但是电镜实验做起来费时费力费钱，准备一个样品都要折腾好半天，更别提几百上千个样品了。现在对病毒检测的原理有两种，一种是通过分子生物学的方法检测病毒的基因，另一种是通过免疫学方法检测病毒的抗体。这两种方法都通过化学反应把微弱的信号进行放大，并且可以根据信号的强弱进行定量分析。

　　2. RT-PCR：目前的扛把子

　　病毒的遗传物质是核酸，可以是双链的脱氧核糖核酸（DNA）或者单链的核糖核酸（RNA）。DNA由腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）四种核苷酸组成，而RNA中胸腺嘧啶变成尿嘧啶（U）。核酸里包含很多基因，每一段基因编码一个蛋白或者RNA。在不同的物种内，编码同一个蛋白或RNA的基因会有或多或少的区别。物种之间的关系越近，区别就越小。如果想要鉴定一个病毒，可以把它的基因和已知病毒的基因进行比对，一般序列相似度在99%以上就可以认为是同一个种。

　　病毒的核酸包含了好几个基因，全测一遍费时费力也没有必要，所以我们只需要鉴定最有代表性的基因片段就够了。就好比识别一个人，不用全身摸一遍，只看指纹或虹膜就行了。这段基因片段叫做探针（probe）。那么探针应该如何选取呢？

　　首先，选取的这个片段要有足够的特异性，能体现不同病毒种属之间的差异。否则你从新冠状病毒中找了一段很多病毒共有的序列来鉴定，然后发现在HIV（艾滋病毒）中也有同样的序列，结果就说这个新病毒是艾滋病毒，那就麻烦大了，很可能会被患者暴打。

　　其次，选取的片段不能太容易突变。好比我们要比较一对双胞胎的长相，放着五官不看，非要看痣长在哪儿，结果因为痣长得不一样就否认他们是一家人。

　　最后，这个片段还要比较容易被测序。如果选的片段和测序的引物（后面会提到）不能稳定结合，会造成测序失败。

　　知道检测哪儿了以后再说说怎么检测。新冠病毒的核酸检测方法叫RT-PCR，RT是逆转录（reverse transcription），PCR是聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction）。因为新冠病毒的核酸是单链的RNA，而PCR需要以双链DNA为模板，所以要先把RNA逆转录成DNA，这就是RT的由来。

　　检测的原理是在病毒的基因上找一个或几个特异的片段，把它们的序列读出来。但是样本中的病毒拷贝数太少了，信号太微弱，所以要通过PCR反应把这些片段大量地复制出来，达到可检测的水平。

　　一段基因有几百上千个核苷酸碱基对，而检测只扩增其中的一两百个碱基对。怎么才能让DNA聚合酶复制出我们想要的片段呢？这就需要我们根据目标基因片段（即模板）序列事先合成好一对引物。所谓引物就是短的单链DNA片段（一般20-40个单核苷酸），它跟模板的头尾的序列互补，可以与之结合形成一小段双链DNA，确定了复制的范围。如果把DNA比作一段铁轨的话，两条引物就分别对应起点和终点，DNA聚合酶就像一列火车在模板DNA的轨道上一路狂飙。

　　PCR反应一般由若干个循环组成，每个循环包含三个步骤：

　　首先，加热变性（93-98C），把模板DNA从双链解离成单链。

　　其次，降温退火（50-60C），让引物和单链模板DNA结合。

　　最后，延长（72C），DNA聚合酶找见引物结合在模板的位置，沿着单链模板DNA开始复制，形成双链DNA。复制产生的双链DNA又被作为下一个循环的模板（图1）。

　　PCR的每一次循环相对于上一次都是指数扩增，所以几十个循环下来，即使起始只有微量的DNA，到最后数量都变得非常可观，可以被仪器检测到。

　　图1. PCR合成DNA原理（https://www.latestgkgs.com/genetics-4934-a）

　　

　　蓝色：目标基因片段，黄色：引物，红色：复制产物

　　扩增出来的DNA片段是怎么读出来的呢？由于复制的时候使用了特殊的带有荧光标记的分子，使得每种核苷酸的颜色不一样，比如腺嘌呤（A）显绿色，胸腺嘧啶（T）显红色，胞嘧啶（C）显蓝色，鸟嘌呤（G）显黄色，根据颜色的顺序可以推断出PCR扩增出来的DNA的序列（图2）。

　　图2. DNA测序结果示意图（https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing）

　　

　　新冠病毒的核酸中有三段基因片段适合用来做检测，分别是位于开放读码框1ab的RdRp基因（RNA聚合酶基因），E基因（小包膜糖蛋白基因）和N基因（核衣壳蛋白基因）（图3）[1]。目前的核酸检测方法是用RT-PCR扩增RdRp基因和N基因的一小段片段。如果两个基因片段都扩增出来了，就叫双阳性，如果只扩增出了一个基因片段，叫单阳性。如果样本中有病毒，但是RT-PCR没有把病毒基因片段扩增出来，就是假阴性。如果RT-PCR的引物没有设计好，把不属于病毒的基因片段扩增出来了，就是假阳性。

　　图3. SARS病毒（NC_004718 SARS-CoV）和新冠状病毒（MN908947 Wuhan-Hu-1）的核酸检测位点

　　

　　因为PCR使用的是专门针对靶点序列设计的引物，所以反应非常专一，特异性强，检测结果比较准确可靠。而且由于反应产物是指数增长，所以即使病毒载量很低时也能得到足够的扩增产物，这样无症状患者也能被检测出来。但是PCR的实验周期比较长，需要等好几个小时才能出结果。另外对设备要求高，需要昂贵的热循环仪（thermal cycler），操作复杂，只有在专门的实验室才能进行。所以如果要进行大规模的检测，我们还需要一种更简便的方法。

　　3. 抗体检测：辅助手段

　　目前另一个常用的检测方法是血清学抗体检测。人在感染病毒后，会首先产生免疫球蛋白M（IgM）作为对抗病毒的第一步反应，之后又产生亲和力更高的免疫球蛋白G（IgG）作为长期免疫应答（图3）。因此通过检测人血清中的病毒抗体IgM和IgG含量就可以知道是否感染了病毒，而且处于免疫应答的哪个阶段（表1）。

　　图3. 人抗体免疫球蛋白的产生曲线

　　

　　红线：免疫球蛋白M（IgM），绿线：免疫球蛋白G（IgG）（https://www.biomedomics.com/products/infectious-disease/covid-19-rt/）

　　表1. 人免疫球蛋白的含量变化（https://pharmact-health.com/en/sars-cov-2-rapid-test）

　　

　　抗体可以通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）或者侧流法（lateral flow test）来检测。两个方法速度都很快，ELISA检测结果精确，可以进行定量分析，但是需要酶标仪，对仪器和操作要求比较高。侧流法只能进行定性分析，但是不需要专门的仪器，操作简单，使用起来就和验孕试纸一样方便。

　　广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室联合国内其他9所科研机构和医院研发出新型冠状病毒抗体快速检测试剂盒，就是用的侧流法（lateral flow test）[2]。他们用体外重组表达的新冠病毒棘突蛋白（S蛋白）作为抗原，让其通过静电作用和胶体金纳米颗粒（AuNP）结合，涂在检测试纸的样品垫（Sample Pad）上。S蛋白负责与抗体结合，胶体金负责显色。在试纸中间有三条带，分别固定了鼠抗人IgM抗体，鼠抗人IgG抗体和抗兔IgG抗体。这三条带分别用M线、G线和C线代表（图4）。M线负责检测IgM抗体，G线负责检测IgG抗体，C线不负责检测，只是做对照用。

　　图4. SARS-CoV-2-IgM-IgG抗体检测试剂盒原理

　　

　　上图：侧流试纸（lateral flow）结构图。

　　下图：反应结果示意图（从左至右：阴性，IgM阳性，IgG阳性，IgM/IgG阳性）

　　检测时，把血液样本滴在试纸的样本垫上（图4中的Sample Pad），样本中的蛋白被试剂带着从试纸的一头流到另一头。如果血液中含有新冠病毒S蛋白的抗体，这些抗体就会与样本垫上的含S蛋白的胶体金纳米颗粒（AuNP-S蛋白）结合，形成AuNP-S蛋白-IgM或AuNP-S蛋白-IgG结合物。

　　当这些胶体金颗粒流到M线时，如果它们中有AuNP-S蛋白-IgM，IgM就会和M线上的抗IgM抗体结合，于是含有IgM的胶体金颗粒就被留在这儿了。聚集在一起的胶体金颗粒把M线变成了紫红色。

　　剩下的胶体金颗粒继续往前走。当它们流到G线时，如果其中有AuNP-S蛋白-IgG颗粒，G线会显紫红色。最后剩下的对照颗粒流到C线，使C线变色。所以如果血液样本中不含病毒抗体的话，就只有C线显示出来；如果只含有IgM抗体的话，就有M和C两条线显示；如果同时含有IgM和IgG的话，就会显示M、G和C三条线出来（图4）。

　　这个抗体检测试剂盒不需要特殊的仪器，检测结果非常直观，而且只需要15分钟就能搞定。检测结果不但可以显示患者处于感染的哪个阶段，还能对其感染历史进行追溯，因为即使患者痊愈了，体内已无病毒，血液中的病毒抗体还存在。将来等我们走到群体免疫那一步的话，就得用这个方法判断被检测者体内是否有病毒抗体产生。

　　和RT-PCR相比，抗体检测只能间接证明被检者是否感染病毒，而不能直接检测人体内的病毒。另外，当病毒处于潜伏期时，人不会产生与之相对应的抗体，这时候抗体检测就不灵了。所以抗体检测不能取代RT-PCR，目前还是辅助手段。

　　4. DETECTR：全村的希望

　　前面介绍了RT-PCR和抗体检测两种方法，一种比较准但是慢，另一种很快但是准确性差点意思。那么有没有集两种方法之大成者呢？它就是基于当前最火的CRISPR技术的检测方法，DETECTR，全名DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，光看名字就觉得很厉害，有木有？发明这项技术的团队是加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna领导的研究小组。在CRISPR领域，Doundna和另一位大神MIT的张锋两人是一时瑜亮，前几年还因为CRISPR的专利打过官司，扯远了。

　　DETECTR的厉害之处有两个，一是等温扩增，二是CRISPR-Cas12a切割。先说等温扩增。之前提到一般PCR反应每次循环有三个步骤，每步温度不同，而DETECTR通过使用RPA（recombinase polymerase amplification）技术，或LAMP（loop-mediated isothermal amplification）技术，把三个步骤都放在同一个温度下进行，三温合一，极大得缩短了反应时间[3]。

　　再看CRIPR-Cas12a切割。CRISPR-Cas家族是一群结构和功能相近的DNA内切酶（DNA内切酶只在DNA中间切特定的序列，DNA外切酶在DNA两头切），它们与事先设计好的向导RNA结合后，可以切开我们想要的目标基因序列，从而实现基因编辑。其中有一个成员叫CRISPR-Cas12a，它在切开目标DNA后（顺式切割），还会激活另一个活性，切割被它抓住的任意单链DNA（反式切割）[4]。这就好比一个杀手砍死了刺杀目标后，一下子杀性大发，顺便把旁边的无辜路人也砍了。

　　研究人员正是利用CRISPR-Cas12a的这个特性，在反应加入一种可以发荧光或显色的单链DNA作为报告分子。当CRISPR-Cas12a切开目标DNA后，随即又切开了单链DNA报告分子，释放出了荧光或显色信号，这样就可以通过ELISA或Lateral Flow试纸检测样本是否含有目标基因片段。

　　种

　　图5显示的是Lateral Flow检测试纸的原理。报告分子带有一种叫生物素（biotin）的维生素分子，被CRISPR-Cas12a切下来后，由于带着生物素的单链DNA片段和胶体金颗粒上的单链DNA片段序列互补，它们就结合到了一起。这些拖着生物素的胶体金颗粒随着试剂流到检测带（test band）。检测带固定着卵白素（avidin）。因为卵白素与生物素之间有很强的亲和力，带着生物素的胶体金颗粒就留在这儿不走了，聚集在一起把检测带变成了紫红色。

　　图5. Lateral flow检测试纸示意图（https://www.milenia-biotec.com/en/product/hybridetect/）

　　

　　DETECTR可以根据目标基因灵活地替换向导RNA，实现对不同病毒基因的检测。面对肆虐的新冠病毒，科研人员已经开发出了相应的DETECTR检测方法[5, 6]。在Curti Lucia等人的论文中，他们用RT-RPA技术扩增新冠病毒的RdRp、ORF1b和ORF1ab基因片段。如果检测对象是新冠病毒阳性，目标基因会被扩增出来，并被CRISPR-Cas12a在相应的向导RNA的协助下切割，释放出携带了生物素（biotin）的报告分子[6]。结合了报告分子的胶体金把试纸上的检测带变红。加上对照带，阳性样品会在试纸上显示出两道杠，而阴性样品只显示一道杠（图5）。

　　图6. DETECTR检测新冠病毒的流程示意图[6]。

　　

　　在James P. Broughton等人论文中，他们选用新冠病毒的N基因和E基因作为靶点，用RT-LAMP技术扩增目标基因片段，然后用lateral flow test方法检测，最后同样在试纸上显示出两道杠（阳性）或一道杠（阴性）[5]。

　　和RT-PCR动辄几个小时的检测时间相比，DETECTR只需要半个小时。它兼顾了RT-PCR检测的准确性和抗体检测的快捷性。而且因为不需要昂贵的热循环仪，DETECTR能够大范围推广，真正做到了更准、更快和更便宜，是非常有前景的检测方法。

　　随着疫情的发展，我相信还会有更多分子生物学、免疫学和蛋白质工程的前沿技术被应用到新冠病毒的检测上，我们很可能会迎来一次诊断技术的爆发。

　　参考文献1.Victor Corman et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020, 25(3).2.Zhengtu Li et al。Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. J Med Virol. 2020 Feb 27.3.Yuanli Li et al, Development of real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification (RPA) for rapid detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples and its comparison with real-time PCR test. nature 2018, 8: 17760.4.Janice Chen et al, CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science 2018, 360(6387): 436–439.5.James Broughton et al, Rapid Detection of 1 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based 2 DETECTR Lateral Flow Assay. medRxiv 2020.03.06.20032334; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.06.200323346.Curti Lucia, Pereyra-Bonnet Federico & Gimenez Alejandra, An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus 2 SARS-CoV-2 sequence detection 3 method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.29.971127