流式中八大常见对照的作用
对照在任何实验中都是非常重要的，对照设置的越充分我们的实验结果可以解读的就越精准。对照在流式细胞术中更是尤为重要，对照有将实验结果和背景区分，排除非特异性的效应，获得高质量的数据结果等作用。
1 空白/阴性对照：即不添加任何额外荧光染色的对照管。设置空白对照用以区分细胞本底的自发荧光及判断药物等外界处理是否会使细胞额外引入自发荧光。除此之外还可以辅助进行补偿的调节，及辅助调电压即光电倍增管电压增益，因为它代表的为可能存在的最负阴性总群体的位置，当然，最适的补偿和电压调节还要依赖于单染管及全染样品管的分辨效果。另，空白对照通常不适用于界定染色样品上的阳性门位置，因为它既不能代表其他荧光通道的泄露或外源刺激导致的本底总阴性群信号的增强，也不能排除感兴趣通道中抗体非特异性结合的实际情况。
2 单染/单阳对照：即只染多色方案中其中一种荧光染色的对照管，单染对照管的数量等于多色方案设计中选择的荧光数量。当进行多色流式实验时，单染对照对于调节补偿是至关重要的。单独染色可显示不同荧光团之间光谱重叠的水平，进而通过仪器上或者分析软件上的补偿调节来去除此重叠。当使用单个染色样品进行补偿时，要考虑的重要事项是荧光基团需要相同，其亮度尽量与实验中使用的相似，确保有明显的阴阳分区，无过多的假阳性信号，且需要收集足够的多的events数才能调节出最准确的补偿值。样本无法满足以上需求时，可使用补偿微球产品替代样本进行补偿的调节。
图1 荧光单染校正光谱重叠：CD45RA FITC(MCA88)单染的淋巴细胞在PE通道中检测到荧光(a)，但在正确补偿后FITC荧光未溢漏到PE通道(b)。
3 同型对照：即用待测样本染了荧光抗体对应的同型抗体的对照管。在流式细胞术中，染色的背景水平是一个重要的影响因素，特别是在较为罕见的低表达或者连续表达的细胞建立多色模板时，需要设置同型对照。同种型对照的作用是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体及静电原因等结合而产生的背景染色，帮助确定圈门位置时，得到真实的目的细胞阳性率。这些对照与目标抗体具有完全一致的抗体来源，并且附着相同的荧光染料。在特定情况下，尤其是当单核细胞被用串联染料如PE/Cy7、APC/Cy7、APC/Fire 750、APC-H7或PE-CF594等标记的抗体染色时，使用同型对照抗体是非常有帮助的。单核细胞倾向于与CY7、Fire 750和H7等染料非特异性结合。造商使用试剂配对同型抗体，专用缓冲液，使用人源抗体或敲除技术去除非特异性结合位点等技术，以减少这一背景。
图 2 单核细胞非特异性染色中，同型圈门的重要性：顶行：人红细胞裂解后的血液样本未染色或用同种型对照 PE/Dazzle 594 或 CD3 PE/Dazzle 594 染色。 底行：使用 APC/Cy7 的类似案例。
4 死活对照：样品中死细胞的存在会极大地影响染色效果，从而影响数据质量。因为死细胞具有更大的自发荧光，而且会增加非特异性的抗体结合，导致假阳性并增加背景信号从而降低阳性信号的动态范围，这可能会使弱阳性样本和稀有群体的鉴定变得困难。另死细胞还无法刺激表达活化功能相关的标志物，从而导致一些比真实阳性率偏低的假阴性结果产生。使用基于前向和侧向散射的门可以帮助清除部分碎片和死细胞，但它无法将它们全部移除。 需要使用用于鉴定死细胞的活性染料，这些染料的类型包括表染可用的核酸类染料，例如PI，7-AAD等，以及表染和破膜样本都可用的蛋白质结合染料如BD的FVS 系列染料。
图3 使用死活染料去除死细胞可以改善染色：人外周血样本：(a)仅使用前向侧向散射图圈出目标细胞，不能去除所有死细胞，非特异性结合仍然存在。(b)使用PI排除死细胞，显示较少的非特异性结合，更容易分辨阳性染色群体。
5 FMO（Fluorescence Minus One）对照：即荧光减一对照，设置示例见下图4。在没有图2所示的情况下，高维流式细胞术中的主要背景信号往往来自补偿泄漏而不是非特异性结合。因此，在没有其他非特异性染色的情况下，FMO对照在设置圈门时通常比同型对照更有参考意义。 
图4.使用FMO对照来确定其他荧光散布及界定精确的阳性门位置。 第一张图为空白对照；第二张图是PE-Cy5的FMO对照，可以看到其它荧光素对该通道产生了散布，使得阴性和阳性细胞群的界限发生了改变；第三张图全染后分析样本，按照黑色虚线精确设定阴阳性界限。
6同型和FMO对照组合：即FMO与被去掉的抗体对应的同型对照抗体的“组合”对照。人们试图结合FMO(考虑溢出)和同型控制(考虑非特异性结合)的好处。虽然这在理论上可能是“两全其美”，但值得一提的是，使用此类型控件仍然存在一些缺点，这些缺点不能通过将其与FMO相结合来缓解。具体地说，特定的同型对照抗体可能具有或不具有与待测抗体相似的非特异性结合特性，并且它可能需要对同型对照进行滴定以更接近那些非特异性结合特性。
7 内部对照：即实验设计上的对照，如刺激前后，加药处理前后，共培养前后等。对于细胞内细胞因子染色，最好的门控对照可能是内部对照（例，来自同一样本的未刺激细胞）。如细胞内染色实验涉及固定和破膜，这些步骤会影响抗原检测，自发荧光，荧光素亮度和细胞形态。
8 生物学对照：生物学对照即已知的结果为阴性或阳性的样本对照。生物学对照对于所有染色都是重要的，尤其是对于具有更高背景荧光的细胞内染色更重要。从文献中已知的表达或缺乏感兴趣抗原表达的细胞，或使用RNAi或CRISPR等技术将抗原敲除的细胞产生阴性细胞，或已转染的细胞并且抗原被过度表达以确保阳性染色的细胞。对于一些实验，例如细胞活化实验，未刺激，已报道过确认可以对样本进行活化的刺激来和自己实验中的刺激方案做对照，对于确定阳性结果和活化水平动态变化是很重要的。
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