六篇Nature探讨肿瘤免疫治疗新策略

　　在慢性病毒感染和肿瘤发生中，由于持续的抗原暴露和长期 T 细胞受体（TCR）信号传导，导致 CD8+ T 细胞耗竭或功能障碍。

　　T 细胞的耗竭与如下多种因素相关：

　　T 细胞增殖能力下降；

　　效应细胞因子分泌的减少；

　　基因表达和代谢的变化；

　　多种抑制性受体（包括 PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、2B4/CD244）的升高和持续表达有关。在稳态条件下，这些抑制性受体，也称为免疫检查点蛋白，在活化的 T 细胞上瞬时表达，通过调节 T 细胞反应的持续时间和强度，在维持免疫稳态中发挥重要作用；在耗竭状态下，这些受体的表达量依然很高，T 细胞活性降低，使得病原体和肿瘤无法有效清除。

　　

　　那么如何逆转耗竭的 T 细胞，让免疫系统恢复强大的杀伤力呢？

　　太长不看版：

　　CTLA-4 或 PD-1 等免疫检查点疗法已获得令人瞩目的临床成就，然其仅对少数患者有效，寻找其他治疗靶标迫在眉睫；

　　转录因子 NR4A1 通过拮抗转录因子 AP-1 介导的基因诱导 T 细胞耐受；

　　NR4A 转录因子家族均参与调节 T 细胞的耗竭，NR4A 三重敲除（Nr4a1-/- Nr4a2-/- Nr4a3-/-）的 CD8+ CAR T 细胞过继输入疗法对实体瘤有显著疗效；

　　TOX 和 TOX2 也参与诱导 T 细胞耗竭表型，且 CAR T 模型的疗效与 NR4A 类似；

　　转录因子 NFAT 同时诱导 Tox 和 Nr4a 家族转录因子，共同介导了 CD8+ T 细胞的耗竭，有望成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。

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　　靶向 CTLA-4 和 PD-1

　　逆转 T 细胞衰竭

　　最初在感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的小鼠中发现了耗竭 T 细胞，随后在感染有丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）以及人类肿瘤中也报告了类似的 T 细胞表型。

　　之后的研究表明，T 细胞耗竭的严重程度通常与共表达的抑制性受体数量相关。因此，研究人员和临床医生尝试使用抗体来靶向一种或多种抑制性受体。这些抗体会阻断它们与各自配体的相互作用，试图逆转 T 细胞耗竭并恢复其功能，从而改善抗病毒和抗肿瘤的免疫应答。

　　

　　阻断 PD-1 或 CTLA-4 示意图[1]

　　该研究思路已显示出非凡的应用前景：例如，针对 T 细胞共抑制受体 CTLA-4 或 PD-1 的单克隆抗体已延长多种肿瘤类型（包括黑素瘤，肾细胞癌，鳞状细胞癌和非小细胞癌）的患者生存期。

　　然而，不幸的是，临床医生发现阻断 CTLA-4 或 PD-1 仅对少数患者有效，许多最初对治疗产生反应的患者后来由于其他抑制性受体的上调而变得耐药或复发。类似地，已经成功治疗白血病和淋巴瘤的 CAR T 细胞疗法由于 CAR T 细胞的耗竭仍未成功用于治疗实体瘤。

　　因此，研究人员开始寻找驱动 T 细胞耗竭的具体因素，以确定肿瘤免疫疗法的其他潜在靶标。

　　转录因子 NR4A1

　　与 T 细胞耗竭

　　2019 年 4 月，发表在《Nature》杂志上的两篇论文报道称，核受体转录因子（NR4A）家族在调节诱导 T 细胞耗竭中发挥关键作用[2-3]。

　　在 Liu 等人的第一篇文章中，作者利用体外 T 细胞耐受诱导系统分析了小鼠耐受 T 细胞（Ttol）的基因表达和表观遗传学特征。这一分析表明，在 Ttol 细胞中，无能（Anergy）相关基因和转录抑制因子被上调，而效应基因及线粒体、核糖体、蛋白酶体相关基因则被抑制[2]。

　　此外，作者表明无能相关基因和耗竭基因（包括基因编码抑制性受体 LAG-3、PD-1、TIGIT）位点均表现出组蛋白赖氨酸甲基化（H3K4me3），即这些基因被 Ttol 细胞活跃转录；而编码不同亚群效应 T 细胞的转录因子和细胞因子的基因 H3K4me3 水平低，转录没有被激活。

　　值得注意的是，Ttol 细胞中一个特殊的转录因子 Nr4a1 表达上调，作者聚焦 Nr4a1 以解析其在效应 T 细胞中的作用。

　　后续实验表明，CD4+ T 细胞中过表达 Nr4a1 会导致无能基因表达上调，而 IL-2 和 IFN-gamma 表达下调。敲除 CD4+ 或 CD8+ T 细胞中的 Nr4a1 会导致 IL-2 和（或）IFN-gamma 表达上调，这表明 Nr4a1 参与介导 Ttol 的表型。

　　在野生型和 Nr4a1-/- 小鼠中使用口服耐受性或肽诱导耐受性模型，没有 Nr4a1 的情况下，Ttol 表型的发展被阻断，说明 Nr4a1 对于体内诱导 T 细胞耐受是必需的。

　　先前的实验观察到 Nr4a1 在慢性病毒相关耗竭 T 细胞中表达上调，作者继续研究 Nr4a1 在淋巴瘤小鼠模型的作用，将 Nr4a1-/- CD8+ T 细胞过继输入到荷瘤小鼠中，表现出 PD-1 和 TIM-3 的低水平表达以及 CD8+ T 细胞更强的肿瘤浸润，相较于野生型 CD8+ T 能更有效地消除肿瘤。

　　他们采用染色质免疫沉淀并测序鉴定 Nr4a1 的结合位点，发现大量 Nr4a1 结合位点与 c-Jun 结合位点重叠，Nr4a1 最多的结合位点为 AP-1 共有序列，表明 Nr4a1 通过拮抗 AP-1 介导的基因表达来诱导 T 细胞耐受。

　　

　　以 NR4A1 为中心的转录模式[2]

　　敲除 NR4A 转录因子

　　改善 CAR T 细胞功能

　　在第二篇文章中，Chen 等人发现 NR4A 家族成员 NR4A1 和 NR4A2 在人黑色素瘤的 CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中表达上调[3]。他们还表明，这些蛋白的表达与 PD-1 和 TIM-3 的表达有着重要的关联，人黑色素瘤和非小细胞肺癌的 CD8+ PD-1high TILs 中，其染色质富含 NR4A 结合基序，表明 NR4A 转录因子家族参与调节 T 细胞的耗竭。

　　作者通过观察野生型 CD8+ CAR T 细胞与 NR4A 三重敲除（Nr4a1-/- Nr4a2-/- Nr4a3-/-）CD8+ CAR T 细胞在两种小鼠实体瘤模型中的功能，进一步研究了 NR4A 转录因子的活性。

　　分析表明，与接受 Nr4a1、Nr4a2 或 Nr4a3 单一敲除 CD8+ CAR T 细胞或野生型 CD8+ CAR T 细胞的小鼠相比，接受 Nr4a 三重敲除 CD8+ CAR T 细胞过继输入的荷瘤小鼠表现出显著的肿瘤消退和更高的存活率。

　　在后续的基因表达和染色质可及性图谱分析中，Nr4a 三重敲除 CD8+ CAR TILs 与野生型 CD8+ CAR TILs 相比，抑制性受体如 PD-1、TIM-3、TIGIT、2B4/CD244 和 CD38 的表达下调、效应基因的表达升高，在含有与效应功能相关的转录因子结合基序的染色质开放区域高度富集。因此，NR4A 转录因子家族调节 T 细胞耗竭，可能是潜在的下一代肿瘤免疫治疗靶点。

　　

　　Nr4a 在抗原长期刺激的 T 细胞中作用[3]

　　TOX 和 TOX2

　　转录因子与 T 细胞耗竭

　　继这两篇文章之后，2019 年 6 月和 7 月发表的一系列文章表明（HMG）-box 转录因子 TOX 和 TOX2 也参与诱导 T 细胞耗竭的表型[4-8]。使用急性或慢性感染小鼠模型，多项研究均证明在慢性病毒感染后产生的耗竭 CD8+ T 细胞中，Tox 表达上调[5-8]。

　　此外，TOX 在多种肿瘤浸润且 PD-1 高表达的 CD8+ T 细胞中也高度表达，并与 CTLA-4、TIM-3、TIGIT、PD-1 的高表达密切相关[6,8]。

　　使用 CAR T 细胞模型，Seo 等人发现与 NR4A 转录因子类似，Tox 和 Tox2 在 PD-1 和 TIM-3 高表达的耗竭 CD8+ CAR T 细胞中被诱导表达[4]。

　　再者，向荷瘤小鼠中过继输入缺失 Tox 和 Tox2 小鼠的 CD8+ T 细胞，相较于输入野生型 CD8+ CAR T 细胞或单一缺失 Tox /Tox2 的 CD8+ CAR T 细胞，表现出显著的肿瘤减少和生存率提高。

　　研究人员也证明了 NFAT 转录因子家族在没有与 AP-1 结合的情况下，参与诱导耗竭 CD8+ T 细胞中 Tox、Tox2、Nr4a2 和 Nr4a 的表达。因此，他们提出一种 NFAT 同时诱导 Tox 和 Nr4a 家族转录因子的模型，共同介导了 CD8+ T 细胞的耗竭。

　　

　　NFAT、NR4A 及 TOX 诱导 T 细胞耗竭的转录机制[4]

　　以上研究表明，抑制 NR4A 和/或 TOX 家族转录因子可能会成为肿瘤免疫治疗强有力的新策略。

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　　[1].Amir R. Aref, et al. (2018) Lab Chip. 3D Microfluidic Ex Vivo Culture of Organotypic Tumor Spheroids to Model Immune Checkpoint Blockade.Oct 9; 18(20): 3129–3143.

　　[2].Liu, X. et al. (2019) Genome-wide analysis identifies NR4A1 as a key mediator of T cell dysfunction. Nature 567:525.

　　[3].Chen, J. et al. Nr4a transcription factors limit CAR T cell function in solid tumors.(2019) Nature 567:530.

　　[4].Seo, H. et al. (2019) TOX and TOX2 transcription factors cooperate with NR4A transcription factors to impose CD8+ T cell exhaustion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 116:12410.

　　[5].Yao, C. et al. (2019) Single-cell RNA-seq reveals TOX as a key regulator of CD8+ T cell persistence in chronic infection. Nat. Immunol. 20:890.

　　[6].Khan, O. et al. (2019) TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature 571:211.

　　[7].Alfei, F. et al. (2019) TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection. Nature 571:265.

　　[8].Scott, A.C. et al. (2019) TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation. Nature 571:270.

　　文章来源：Bio-Techne

　　图片来源：Bio-Techne

　　题图来源：站酷海洛