1＋1＞2！别傻傻地只会用单一热点，不如试试“2大国自然热点结合”，让研究开挂！
炎癌转化，即炎症与癌症之间的相互转化过程，被认为是癌症发生重要途径之一。正如下图所示，近10年来【炎癌转化】相关领域的项目数量呈直线上升，资助的金额也逐年增加。
图1. 炎癌转化的申请趋势
CircRNA，作为小RNA的一种，也是近年来国自然申请的热点之一。在PubMed上检索“circRNA”关键词，仅2021一年就发表了3600多篇；而2022年国自然申报过程中，circRNA的中标数量高达221项，排在第12位！
那么，二者碰撞后会出现什么样的现象呢？会不会出现1+1>2的现象呢？
今天我们就以发表在Nature Communications上的一篇文章“Mutant RIG-I enhances cancer-related inflammation through activationof circRIG-I signaling”来向大家介绍“如何背靠背两大热点，发表高分文章，顺利拿下国自然”吧！
一、临床问题
除了肿瘤起始外，炎症状况还会促进癌细胞侵袭和远端转移，甚至增加癌细胞对免疫治疗的抵抗力，因此，阐明调节癌症相关炎症的机制对于癌症预防和治疗至关重要。（确认表型：炎癌转化）
二、科学问题
RIG-I，即CircRNA在肿瘤的发生和炎症调节中扮演着重要作用，但其潜在调控机制及具体作用并不明确。（确定分子及研究思路：RIG-I和CircRNA）
三、研究思路
1.RIG-I的移码突变加剧结肠炎相关癌症
（目标基因RIG-I在目标表型“炎癌转化”中的作用）
2.RIG-I的移码突变出发了环形RIG-I的RNA（CircRIG-I）产生
（偶联热点-CircRNA，将基因与其CircRNA相联系）
3. 确认CircRIG-I在结肠癌临床样本中的表达
（确认下游RNA的临床意义）
4. CircRIG-I激活DDX3X介导的先天免疫信号
（寻找到CircRNA的下游分子机制-激活炎症的分子机制）
5. 利用全反式维甲酸抑制RIG-I的表达改善结肠炎性病变
（最好找寻一个已知的，成熟的抑制剂，对这个结果进行更深入层面的转化意义探讨，完成文章闭环）。
四、研究内容
Figure1. RIG-I的移码突变加剧结肠炎相关癌症
C：构建RIG-I突变的小鼠，证明其对小鼠发育影响不大；（先进模型：基因工程小鼠，建议参考）
D-E：通过检测AOM/DSS诱导的结肠炎小鼠血清中CA19-9及CEA肿瘤标志物的水平明确RIG-I移码突变对肿瘤发生的影响；
F-I：通过结肠宏观肿瘤数量及HE染色确定RIG-I移码突变对结肠炎诱导的结肠癌发生的影响；
J-I：通过流式细胞术检测RIG-I移码突变后对脾脏中各种免疫细胞数量的影响。
图1. RIG-I的移码突变加剧结肠炎相关癌症
Figure2. RIG-I的移码突变触发circRIG-I的产生
F：使用RNAfold网络服务器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）预测RNA二级结构，发现移码突变相对于野生型RNA显着损害了茎环结构；
G：CLIP-seq分析发现RIG-I与免疫调节因子DHX9的富集峰一致；
H：Pull-Down实验证明Rig-I的移码突变显着损害了其与DHX9的关联；
形成假说：Rig-I的移码突变可以从RIG-I转录本触发circRNA的生成（搭上CircRNA的热点）。
I：处理病毒感染的WT和Rig-i中核糖体RNA去除的总RNAFS/FS带有RNase R的MEF降解线性RNA并富集circRNA，进行高通量RNA测序，并发现CircRNA的形成。
J：DNA凝胶电泳显示circRIG-I丰富且耐RNase R处理；
K：Western blot区分circRIG-I及其宿主基因RIG-I；
I：RNA荧光原位杂交（FISH）发现circRIG-I主要定位在细胞质中；
M-N：qRT-PCR测定，发现FS/FS与WT MEFs相比，circRIG-I的转录增加。
图2. RIG-I的移码突变触发circRIG-I的产生
Figure3. CircRIG-I在结肠癌中上调
A：基因测序发现人类circRIG-I的预测剪接连接；
B-H：qRT-PCR测量了circRIG-I在结肠癌组织及其匹配的相邻正常组织中的表达（B），溃疡性结肠癌表达的circRIG-I水平高于息肉样结肠癌（C），circRIG-I的上调与肿瘤（III/IV）分期和患者年龄高度相关，而与患者的性别、肿瘤亚型和位置没有显著相关性（D-H）。
总结：通过临床意义及临床样本进一步扩大其临床意义，并明确其下游CircRNA的临床意义。
图3. CircRIG-I在结肠癌中上调
Figure4. CircRIG-I激活DDX3X介导的先天免疫信号
A：生物素亲和进行免疫沉淀，并使用质谱纯化分析circRIG-I相互作用蛋白；
B：硝酸银染色，同时搭配质谱鉴定，发现circRIG-I可能与DDX3X互作；
C-E：免疫共沉淀（C）、共定位（D）、交联免疫沉淀（E）进行验证；
F-G：免疫沉淀和质谱（MS）鉴定存在或不存在circRIG-I的情况下DDX3X相关蛋白的动态变化；
H：免疫共沉淀进行验证。
总结：明确RIG-I/CircRIG-I调控免疫反应的下游分子，此处可利用免疫沉底寻找互作直接互作蛋白，也可通过组学技术寻找下游通路。
图4. CircRIG-I激活DDX3X介导的先天免疫信号
Figure5. 全反式维甲酸减轻RIG-I结肠炎性病变小鼠
全反式维甲酸（ATRA）可抑制RIG-I
D：ATRA处理在RIG-I移码突变的情况下削弱了circRIG-I的上调；
E-H：生存分析、肿瘤宏观观察及HE染色结果发现ATRA显着改善了急性DSS诱导的结肠炎的小鼠的生存、肿瘤发生和病理情况。
总结：最后可以用成熟抑制剂或者筛选新的抑制剂进一步增强文章的转化意义，完成文章闭环。
综上所述，本文利用了两大科研热点「炎癌转化」+「CircRNA」，并对二者进行了有机地结合，完成了“基因-CircRNA-下游互作蛋白-炎癌转化表型”这一条完整的故事线，因此成功地发表了高分文章。
此外，本文中还应用到了很多这两个领域的经典实验技术，小编也对其进行了标注，值得大家收藏哟！
参考文献：
撰文：TS