抗体药物体外药理学实验全面解决方案
抗体类药物单抗、双抗、ADC (antibody-drug conjugate)近年发展迅速，在肿瘤、自身免疫疾病领域已有多款重磅产品，在感染、代谢性疾病，神经退行性疾病等领域的研究也受到越来越多的关注。体外药理分析是验证抗体活性，探索抗体作用机制（MOA），提供药物IND申报依据的重要手段。体外药理分析需要根据抗体特点，靶点的特性来设计相应实验，分析方法主要包括基于流式、报告基因，细胞成像的细胞分析和基于HTRF, MSD, AlphaLISA ，ELISA，Luminex，等可溶性蛋白的分析。本文将主要介绍抗体药发研发当中涉及的细胞增殖，细胞凋亡，细胞因子释放，MLR(混合淋巴细胞反应) ,体外细因子释放，磷酸化蛋白检测，等相关的解决方案。
在体外进行抗体药的筛选和功能性检测是抗体药早期发现非常关键的一步，这直接决定了这些抗体药的命运。优宁维提供一系列用于抗体药体外活性检测的试剂，确保您的抗体药体外药效学筛选可以顺利进行并最终获得具有优质药效的分子。一．ADCC解决方案ADCC(Antibody dependent cytotoxity)是一种抗体依赖的细胞杀伤作用，一般为自然杀伤细胞（Nature killer cell ，NK）介导。抗体Fab端结合靶细胞表面抗原，Fc端结合NK细胞表面的Fc受体CD16,将靶细胞与NK细胞拉近距离，并激活NK细胞释放颗粒酶和穿孔素等，最终导致靶细胞被裂解。 
1.1基于报告基因的抗单克隆抗体 ADCC 生物学活性测定利用 Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa 转基因细胞系作为效应细胞, WIL2-S或其他 细胞系作为靶细胞, 通过荧光素酶检测系统 (Britelite Plus system) 进行抗单抗的 ADCC 生物学活性检测.
当抗体的Fab段与靶细胞上抗原结合以后，抗体的Fc段与效应细胞Jurkat-NFAT-Luciferase(New)-CD16细胞膜表面CD16（FcγRIIIA）结合，引起CD16（FcγRIIIA）胞内信号域发生活化，激活Syk蛋白，Syk蛋白的活化导致内质网内Ca+外流，从而使得细胞质内Ca2+浓度上升，Ca2+与Calmodulin(钙调蛋白)结合以后，可进一步向下游传递信号，使得处于抑制状态的磷酸化NFAT去磷酸化，解除抑制状态，NFAT转移至细胞核内，导致NAFT相关的启动子基因活化，启动Luciferase基因表达。通过检测不同抗体浓度下，Luciferase表达水平，可以评估相关抗体的ADCC活性。ADCC效应的强弱，与抗体抗原亲和力强弱，抗体的Fc段类型及抗体浓度等，密切相关。荧光素酶报告基因检测试剂 
（中检院有关新冠中和抗体活性评价的研究,就是这一款试剂盒）1.2 ADCC Endpoint Assays与 51Cr 释放法检测原理类似的 BATDA 法是基于时间分辨荧光测定的非放射性方法，与 51Cr 释放法不同的是该方法不使用放射性元素标记靶细胞却达到与51Cr 释放法同水平的敏感性。该方法基于用疏水性配体 BATDA 对靶细胞进行标记，该乙酰羟甲基酯能迅速跨膜， 当其进入细胞内后，经胞内乙酰酯酶将酯键水解形成亲水性配体 TDA， TDA 不能跨膜从而留在胞内。当靶细胞被杀伤而发生裂解后，胞内 TDA 随即释放入含有铕(Eu)溶液的上清，并与铕结合形成高荧光且稳定的鳌合物（EuTDA） ，该螯合物的量与被杀伤的靶细胞数量呈正相关，因此能对免疫细胞的体外杀伤效力进行评价。
作为放射性检测的替代方法，更为安全的DELFIA EuTDA细胞毒法在ADCC活力检测中具有众多优势。相较于无法区分非特异死亡的LDH检测，EuTDA法不受效应细胞死亡和裂解的影响，降低背景的同时提升了检测的窗口和稳定性。相较于Calcein，BATDA能有效标记脆弱细胞，迅速被细胞摄取和在细胞裂解下完成的释放，为ADCC检测提供了稳定的检测窗口和易于标准化等优势。同时，EuTDA细胞毒法不受效应细胞限制，灵活支持利用多种原代免疫细胞（如PBMC和NK细胞）和更为稳定的改造细胞系的ADCC检测。
1.3 通过检LDH的释放法乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮的过程中，使氧化性辅酶（NAD+）变成还原型辅酶（NADH）, NADH在电子介体存在的情况下还原水溶性四唑盐(WST)以产生。橙色福尔马赞染料。甲醛染料的产生量与乳酸脱氢酶的产生量成正比释放到介质中，表明有细胞毒性。 
二．体外细胞因子释放试验（CRA） 单克隆抗体（mAb）类的免疫调节疗法具有不期望的免疫反应的固有风险。细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）是一种以免疫细胞分泌促炎细胞因子为特征的快速全身炎症反应。细胞因子释放测定法（CRA）是一项利用从健康受试者中采集的免疫细胞进行的体外评估。该测定法旨在检测全血或分离的淋巴细胞制剂在接受受试药物治疗时是否诱发了细胞因子风暴。对照具有相似或已知作用机制的已知阳性和阴性治疗复方制剂直接测量所获得的反应。 用复方制剂培养之后，采集和存储上清液样本。 对于所有测定形式，常规评估的细胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα等）进行定量分析。 在首次人体剂量给药前正确识别CRS的潜在风险对患者安全至关重要。为此，各种体外细胞因子释放试验（CRA）通常被用作新型治疗性单克隆抗体临床前安全性评估的一部分。2.1超敏多因子电化学发光法检测细胞因子—灵敏度高，线性范围款，因方法学本身的灵敏度高，线性范围宽是CRA首选方法。 
产品参数：
MSD方法学优势：1. 灵敏度可达0.05pg/ml。2. 样品兼容度高，基质效应小。3. 节省样品用量，可实现多因子检测。4. 有效线性范围达 6log。5. 适用不同样本基质（血清，血浆，细胞培养上清，脑脊液等）。
2.2CBA法测定细胞因子Cytometric Bead Array（CBA）,即细胞因子微球检测技术.是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。
CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。 
CBA技术特点CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面，捕获微球与待测样品后，呈悬浮态，与ELISA相比，能更有效地捕获被分析物；CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:
1.轻松实现多重检测最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。2.样本需要量小,仅需要50μL溶液就可进行一次检测。3.更高的灵敏度,分析灵敏度高达2.8pg/mL4 .更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性,CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量，排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。5. 检测对象的灵活组合—BD CBA Flex SetCBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标，形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣，BD于2005年初推出了CBA Flex set。它改变了CBAkit的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标，最多能同时检测75个指标。除了拥有CBA kit的优势外，Flex Set还配有独立的软件分析系统（CBA Flex Set Analysis Software），并且可以在BD FACSArray Bioanalyzer上，直接用96孔和384孔板进行操作。CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由，更大的选择空间，而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析.6 操作简单，省时省力CBA技术采用芯片式集成测定，所有检测只需一组标准曲线，就可计算出每种待测蛋白浓度；操作简单，整个流程只需要3.5小时，对待测样本可做实时分析，缩短检测了时间，提高了检测效率。7 强大的软件分析系统BD CBA软件具有强大的数据处理能力，直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度；除了为用户提供待测物的计数结果外，还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。
2.3HTRF技术检测细胞因子：混合+孵育+读板HTRF细胞因子采用夹心分析法检测，使用两种不同的特异性抗体，一种用Eu（供体）标记，另一种用d2（受体）标记。当标记的抗体与同一抗原结合时，供体用光源（激光或闪光灯）激发，触发向受体的荧光共振能量转移(FRET)，进而在特定波长(665nm)发出荧光。这两种抗体与样本中存在的T细胞因子结合，从而产生FRET。信号强度与形成的抗原-抗体复合物的数量成正比，因此也与检测的细胞因子浓度成正比。实验仅需在空板中加入16μl检测样本，然后加入4μl检测抗体孵育2小时后即可使用酶标仪进行读数。
HTRF检测细胞因子优势：1：成本低，操作简单（混合+读板），是免洗“ELISA”技术2：省时省力，仅需2h3：节省样本（只需16ul），适合高通量检测（96孔板+384孔板兼容）4：实验体系稳定、CV值低（可控制5%以内）；数据比值处理，假阳/阴性率低
部分产品清单：
2.4 更高灵敏度均相细胞因子检测技术 
AlphaLISA新一代高性能细胞因子检测试剂盒现已上市，下图对新AlphaLISA细胞因子试剂盒和旧版细胞因子试剂盒的检测能力进行了对照，以检测Human IL-2为例，待分析物类型为重组蛋白(左)，PBMC上清(右)。从图中我们可以看出新的单克隆抗体组合在重组蛋白和内源性样本检测中均显示了更高的灵敏度和实验窗口。 
三．蛋白磷酸化检测
抗体的结构决定其作用机制，其Fab段可以识别游离分子(VEGF、TNF等)靶点和细胞表面的受体(CD20、CD19，EGFR等)，如：西妥昔单抗不仅可以阻断生长因子与EGFR相互作用, 同时也直接阻断突变EGFR配体非依赖的信号通路, 表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α (TGF-α)活化膜受体EGFR酪氨酸激酶, 促进EGFR构象变化形成二聚体, 激活下游信号包括Ras、Raf和PI3K-AKT等 进而获得抑制肿瘤发生发展的效用。所以信号通路关键蛋白磷酸化是广大药物研发科学家关注的。 
HTRF对比传统的WB有30倍以上的灵敏度，相比于Wb的半定量，HTRF可以到完整的剂量反应曲线。
四．免疫检查点抑制剂筛选测定试剂盒 
基于HTRF技术的免疫检查点抑制剂筛选试剂盒，可以快速，高通量的筛选免疫检查点抑制剂
六．细胞因子和细胞因子受体抑制剂筛选试剂盒以为IL-17试剂盒为例HTRF IL17A/IL17RA结合试剂盒用于测量IL17A和IL17RA蛋白之间的相互作用。未经处理，IL17A与IL17RA结合，每个检测抗体与其各自的标记蛋白结合产生HTRF信号。在化合物或抗人封闭抗体的存在下，IL17A/IL17RA的相互作用被破坏，HTRF信号减弱。 
五．MLR混合淋巴细胞反应混合淋巴反应（Mixed Lymphocyte Reaction，简称MLR），也称作混合淋巴细胞培养（MLC），是一种原代的DC细胞和T细胞共培养的系统，该系统经常会被用来评估DC介导的T细胞活化。
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3.8细胞增殖/毒性分析CFSE或VPD450是细胞增殖染料，细胞质会与染料结合，分裂一代之后胞浆内染料浓度减半，再次分裂，胞浆内染料浓度降低为原来的四分之一。随着分裂代数的增加，染料浓度逐渐降低，荧光强度降低。 
检测细胞增殖过程也可以用BrdU的方法来进行，BrdU是胸腺嘧啶T的类似物，在培养细胞过程中在培养基中加入BrdU，BrdU在合成DNA过程中会随机插入到DNA中，之后对细胞固定破膜，用DNA酶处理之后，用BrdU的抗体进行染色，即可得到细胞增殖的结果。一般BrdU会与PI或7-AAD共染，典型实验结果如右图，明显分为红色G0/G1群体，黄色G2/M群体，以及绿色的S期群体。根据S期细胞比例的不同，来确定细胞增殖的变化。
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