多光子显微镜

　　多光子显微镜

　　在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。

　　多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS) 和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够最大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低GDD 特性。

　　如图2所示，典型的系统由激发激光器、扫描和成像光学器件、灵敏检测器（通常是光电倍增管）和用于将荧光与激光器分离并阻挡激光的滤光片（二向色分光镜）组成从到达检测器（发射滤光片）。

　　多光子成像系统提供的优势包括真正的三维成像、对活组织内部深处进行成像的能力以及消除平面外荧光。

　　使用这种方法，可以对斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的荧光染料进行成像，甚至可以对样品或组织中固有的荧光分子进行成像。多光子成像的缺点包括需要高峰值功率脉冲激光器，例如锁模钛：蓝宝石激光器，并且直到现在，缺乏在整个发射范围内提供足够吞吐量的高性能滤光片。整个激光调谐范围内的兴趣和足够的阻挡（图3）。

　　

　　图1：来自暴露的小鼠皮层的双色体内双光子成像。NADH荧光（红色）和硫罗丹明标记的星形胶质细胞（绿色）使用BrightLine FF01-680/SP 发射器和FF665-Di01 二向色镜拍摄。图片由罗彻斯特大学医学中心神经外科系Karl A. Kasischke 和Nikhil Mutyal 提供。

　　

　　图2：多光子荧光显微镜的典型配置。

　　

　　图3：多光子显微镜需要在非常宽的光谱范围内控制光：从近紫外一直到近红外。

　　针对多光子显微镜优化的Semrock滤光片

　　Semrock通过引入具有超高透射率、非常陡峭的边缘和精心优化的阻挡的滤光片，为多光子用户带来了增强的性能。考虑到激发激光器和多光子成像系统的其他复杂元件通常需要多少投资，这些新的光学滤光片代表了一种简单且廉价的升级，可以显着提高系统性能。

　　BrightLine 发射滤光片提供从近紫外到近红外的清晰透射（图4）。事实上，与传统滤光片的褐色色调相比，发射滤光片看起来像窗户玻璃一样清晰，而且LWP二向色镜具有如此宽的反射带，它们看起来像高反射镜（图5）。发射滤光片还在Ti:Sapphire激光调谐范围内提供深度阻挡，这对于实现高信噪比和测量灵敏度至关重要。

　　有时需要限制在任何给定时间检测到的荧光发射光谱带，特别是当使用多个荧光团标记样品中的不同目标时。较窄的带通滤光片非常适合此目的，Semrock提供了多种此类带通滤光片，可与多光子发射滤光片结合使用，几乎不会丢失荧光信号。

　　由于非线性光学效应强烈依赖于激光脉冲的峰值强度，因此当脉冲展宽（以及随之而来的峰值强度降低）保持在最低限度时，会产生最有效的成像。BrightLineFF670-SDi01 和FF720-SDi01短波通二向色分束镜旨在将激发激光反射到样品，同时提供返回的近紫外和可见荧光或SHG信号的出色传输。与从这些分束镜反射的激光相关的群延迟色散(GDD)非常低。例如，对于FF670-SDi01滤光片，100fs 变换限制高斯脉冲在整个激光波长范围内的加宽小于2%，而对于FF720-SDi01滤光片在整个激光波长范围内的加宽远小于1%。

　　

　　图4：BrightLine多光子滤光片提供近乎理想的性能，如“近紫外和可见光”发射滤光片FF01-680/SP 和二向色镜FF665-Di01 的这些典型测量光谱所示。

　　

　　光学密度（OpticalDensity或称为OD）是描述光通过高度阻挡的光学滤光片（当光的传输非常小时）的透过率的一种方便工具。OD简单地定义为对数（底为10）的负变量。变量在0和1之间变化(OD= – log10(T))。因此，透过率就简单等于10的负OD值的方 (T= 10– OD)，左图显示了OD的影响：6个数量级（1000000次）的透过率变化，非常简单地用介于0到6的数字来表示；下面中间的示例表和右下的“法则”列表提供了一些方便的技巧，可以在OD和透过率之间快速转换。将变量T乘以2（或除以10）等于减去0.3（或加上1），就转换成了OD。

　　光密度本底噪声：

　　通过精心优化我们的测量设备和方法，Semrock能够提供一些优化的宽带光密度（OD）。以下是此网站上显示的大多数测量数据的典型OD噪声本底限制。

　　对于介于320和1120nm之间的波长，接近或低于3e-7（光学密度6.5）的透射值受到测量噪声的限制。

　　对于波长<320nm且在1120-1500nm之间的波长，接近或低于3e-6（光学密度5.5）的透射值受到测量噪声的限制。

　　对于大于1500nm的波长，接近或低于1e-5（光学密度5.0）的透射值受到测量噪声的限制。

　　同样，对于某些滤光片和/或某些阻挡波长范围，显示的本底噪声仅为OD4。

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