Life Med ｜ 高栋／金钢／王红阳通过构建肝胆管类器官揭示细胞命运决定关键
肝脏是维持人体正常生命活动的多功能器官，其功能的主要承担者是肝细胞和胆管细胞。中国是肝炎感染的高发国家，因此重症肝脏疾病在中国的发病率也非常高。肝脏移植仍然是重症肝脏疾病治疗最有效的治疗手段。
肝脏移植需求高与肝脏供体不足的矛盾激发了体外构建功能性肝脏器官模块的研究。虽然肝细胞承担了肝脏绝大部分的功能，但在肝脏移植过程中，胆管细胞功能的损伤会导致肝脏移植的失败，因此构建具有胆管管道化特征的功能性肝胆管结构相比于形成单一的肝细胞或胆管细胞更具有优势，而目前成体细胞来源的肝胆管结构仍然是缺乏的。在肝脏发育过程中，肝细胞和胆管细胞来源于同一个肝干细胞，然而肝细胞与胆管细胞形成的调控机制尚未阐明。
为解决上述问题，2022年11月，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心高栋团队、上海长海医院肝胆胰脾外科金钢团队和国家肝癌中心王红阳团队合作在Life Medicine杂志在线发表了题为Functional hepatobiliary organoidsrecapitulate liver development and reveal essential drivers of hepatobiliary cell fate determination的研究论文。
研究人员构建了成体肝细胞长期扩增的类器官培养体系，并利用扩增的肝细胞形成了同时具备肝细胞和胆管细胞的功能性肝胆管类器官。这些肝胆管类器官移植在小鼠体内也能形成肝胆管结构。通过RNA-seq和ATAC-seq的多组学分析发现，该肝细胞类器官培养体系可以模拟肝脏发育过程；通过功能验证发现了能分别促进肝细胞和胆管细胞形成的转录因子Ddit3和Tead4。该研究为体外研究肝脏发育和再生提供了研究策略和研究模型。
首先，研究人员分离并培养了小鼠中的成体肝细胞，通过类器官培养体系进行长期扩增培养。在培养过程中研究人员发现肝细胞形成的类器官经历了从实心球体（Solid hepatocyte organoid，SHO）到空腔结构 （Hollow hepatocyte organoid，HHO）的转变；在转变为HHO后，肝细胞的增殖能力显著提高。随后研究人员以HHO为来源，结合悬浮培养体系，形成了复杂的结构。通过免疫荧光染色和RNA-seq测序分析，研究人员发现形成的复杂结构表达肝细胞的标志物Alb和Hnf4a等和胆管细胞的标志物Krt19等，并将其命名为肝胆管类器官（Hepatobiliary organoid，HBO）；进一步通过功能分析发现HBO也具备肝脏糖原脂质储存、胆固醇代谢和药物代谢相关的细胞色素P450家族等肝脏功能。此外，研究人员发现将这些HBO移植到肝脏损伤的免疫缺陷FRG小鼠（Fah-/-/Rag2-/-/ Il2rg-/-）的肝脏或肾包膜中都能形成含有肝细胞和胆管细胞的肝胆管结构，并且形成的胆管细胞可与宿主中的胆管网络建立连接。
这些结果表明肝细胞也可以形成功能性的肝胆管功能模块，发挥肝脏的功能，修复损伤的肝脏组织。
随后研究人员通过RNA-seq和ATAC-seq对培养过程中的SHO、HHO和HBO进行整合分析。结果表明，与类器官的形态变化相一致，在SHO到HHO的转变过程中，肝细胞的转录特征也发生了变化，SHO高表达肝细胞功能基因如Alb，而在HHO中这些基因的表达水平显著降低，取而代之的是增殖与干性相关的基因如Epcam的高表达，在形成HBO之后肝脏功能相关的基因如Alb又重新表达。进一步通过干性分析发现在SHO到HHO转变过程中肝细胞的干性逐渐升高，在从HHO到HBO的过程中，肝细胞的干性逐渐降低。此外，通过将SHO、HHO和HBO的转录组数据与胚胎发育不同阶段的肝干细胞的转录组数据进行相关性分析发现SHO和HBO与胚胎发育晚期（E17.5d-E18.5d）的肝干细胞的相似性更高，而HHO与胚胎发育早期（E10.5d-E11.5d）的肝干细胞的相似性更高。
这些结果表明体外培养的肝细胞类器官能在一定程度上模拟体内肝脏发育的过程。 由于转录因子是细胞命运决定的重要调控因素，因此研究人员希望通过寻找调控肝细胞类器官转变的关键转录因子来探索调控肝细胞和胆管细胞形成的调控因子。基于此，研究人员利用SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering）的分析策略对SHO、HHO和HBO的RNA-seq和ATAC-seq数据进行整合分析，一共找到了116个在SHO、HHO或HBO中显著活跃的转录因子，其中包括已被文献报道的肝脏发育调控的经典转录因子Hnf4a，Ppara和Hnf1b等，也有之前未在肝脏发育中进行研究的转录因子Ddit3和Thrb等。将这些转录因子与肝细胞特征基因集与胆管细胞特征基因集进行表达水平的相关性分析，找到了与肝细胞基因表达呈显著正相关的转录因子Ddit3和与胆管细胞基因表达呈显著正相关的转录因子Tead4。
研究人员发现在HHO中过表达Ddit3或者敲低Tead4会促进肝细胞的生成而抑制胆管细胞的生成，而敲低Ddit3或过表达Tead4会抑制肝细胞的形成而促进胆管细胞的形成。 总体而言，该研究建立了肝细胞长期培养的类器官培养体系，形成了由成体肝细胞来源的肝胆管类器官。证明了体外的类器官培养体系可以模拟体内肝脏发育的过程。并且利用该模型寻找了调控肝细胞和胆管细胞形成的转录因子Ddit3和Tead4，说明该模型可以用于研究肝细胞和胆管细胞形成的调控机制。该研究为肝脏发育、再生以及疾病提供了潜在的研究平台。
分子细胞科学卓越创新中心高栋研究员、上海长海医院肝胆胰脾外科金钢教授和国家肝癌中心王红阳院士为本文的共同通讯作者，分子细胞科学卓越创新中心何娟博士后和崔皓月研究生为本文的共同第一作者。该研究得到国家自然科学基金、科技部重点研发计划和中科院先导专项的经费支持。
引用本文：
Juan He, Haoyue Cui, Xiaohan Shi, Qiqi Jin, Ximeng Han, Tiantian Han, Jiayin Peng, Shiwei Guo, Lei Zhang, Yun Zhao, Bin Zhou, Luonan Chen, Lei Chen, Yi Arial Zeng, Hongyang Wang, Gang Jin, Dong Gao, Functional hepatobiliary organoids recapitulate liver development and reveal essential drivers of hepatobiliary cell fate determination, Life Medicine, 2022, lnac055, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac055
作者简介
王红阳
国家肝癌中心
1992年毕业于德国乌尔姆大学，获临床生化专业博士学位。中国工程院院士，发展中国家科学院院士，教育部长江特聘教授，主任医师，博士生导师。现任国家肝癌科学中心主任、国际合作生物信号转导研究中心主任。兼任中国抗癌协会副理事长，中国医师协会精准医学专委会主任委员，上海市医学会副会长。获首届国家科学技术进步奖创新团队奖、国家自然科学二等奖、上海市自然科学一等奖以及军队科技进步一等奖等多个重大奖项。在Cancer cell、Cell Res等国际有影响的主流期刊发表SCI论文200余篇；近五年申报发明专利28项，已获授权12项（国际专利2项）。
金钢
上海长海医院肝胆胰脾外科
中国人民解放军海军军医大学第一附属医院（上海长海医院）胰腺外科主任，主任医师、教授，上海市胰腺病研究所副所长。获得“上海市优秀学术带头人”、“上海市领军人才”等项目的支持。曾获国家科技进步二等奖1项、上海市科技进步一等奖1项、上海市医学科技奖一等奖1项、军队医疗成果二等奖3项、军队医疗成果三等奖2项。在Lancet Oncol、Nat Commun等学术期刊发表50余篇研究论文。
高栋
中科院分子细胞科学卓越创新中心
2011年毕业于北京大学，获理学博士学位。中科院上海生化与细胞所研究员、研究组长、博士生导师。主要研究方向为：类器官构建与肿瘤等疾病研究。获得“国家杰出青年基金”、“上海市优秀学术带头人”、“中科院创新交叉团队”等项目的支持。近年来在Cell、Nat Genet、Cancer cell、Cell Stem Cell、Cell Res等著名学术期刊上发表论文50余篇。
制版：嘉明