杂交瘤技术（单克隆抗体制备）
【实验原理】
骨髓瘤细胞能在体外无限制分裂增殖，B淋巴细胞（抗体形成细胞）经抗原免疫后能合成分泌抗体。骨髓瘤细胞和B淋巴细胞经融合剂融合后形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能在体外无限繁殖，又能合成分泌抗体。通过检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，由其产生的只识别抗原分子上某一抗原决定簇的抗体，即为单克隆抗体。
【材料与仪器】
1. RPMI1640、小牛血清。
2. HAT选择培养液：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）；氨蝶呤钠（aminopterins odium，A）；胸腺嘧啶（thymidine，T）。
3. 细胞冻存液：50％小牛血清；40％不完全培养液；10％DMSO（二甲亚砜）。
4. 细胞性抗原、福氏完全佐剂、75％酒精、PEG。
5. 弯头滴管、BALB／c小鼠、无菌注射器、无菌剪刀、96孔培养板、不锈钢筛网、一次性塑料培养板及培养瓶。
6. 倒置显微镜、低温离心机、低温冰箱、液氮罐等。
【实验方法】
一、细胞融合前准备
（一）免疫BALB／c小鼠
1.细胞性抗原
（1）初次免疫：1×107／0.5ml小鼠腹腔内注射。
（2）第二次免疫：初次免疫2～3周后，1×107／0.5ml小鼠腹腔内注射（ip）。
（3）加强免疫：3周后，1×107／0.5ml小鼠腹腔内注射或静脉内注射。3天后，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2. 可溶性抗原
（1）初次免疫：1～50μg抗原加福氏完全佐剂皮下多点注射（一般4～5点／只，0.2ml／点）。
（2）第二次免疫：初次免疫3周后，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或腹腔内注射，剂量不宜超过0.5ml。
（3）第三次免疫：3周后，剂量同上，不加佐剂，腹腔内注射。
（4）5～7天后采血测其效价，检测免疫效果。
（5）加强免疫：2～3周后，50～500μg抗原，腹腔内注射或静脉注射。3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
（二）饲养细胞
在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备：1.6～10周龄BALB／c小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精，消毒3～5min。用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入6～8ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200r／min离心5～6min。用20％小牛血清或胎牛血清的培养液混悬，调整细胞数1×105／ml。2.加入96孔板，100μl／孔，放入37℃、CO2孵箱培养24h后使用。
（三）骨髓瘤细胞
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2／O、P3－X63／Ag8、X63－Ag8.653等。用于骨髓瘤细胞的培养液有RPMI1640、DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10％～20％，细胞的最大密度不得超过106／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20h，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞，活细胞计数高于95％，这也是决定细胞融合成败的关键。（四）免疫脾细胞通常取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较高，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，脾细胞数为2×108左右。
二、细胞融合选择杂交瘤细胞
（一）细胞融合流程
1. 取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2／O，1000r／min离心5min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
2. 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
3.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200r／min离心8min。
4.弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
5.轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
6.在室温下融合
（1）30s内加入预热的1ml45％聚乙二醇（PEG，Merek，相对分子质量为4000，含5％DMSO），边加边搅拌。
（2）作用90s，若冬天室温较低时可延长至120s。
（3）加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7.800r／min离心6min。
8.弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。10ml
9.根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，每块96孔培养板10ml。
10.将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
（二）HAT选择杂交瘤细胞骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT），对氨蝶呤钠敏感，在HAT选择培养液中不能生长。免疫脾细胞虽然有HGPRT，但不能在体外无限繁殖。只有杂交瘤细胞，才能在HAT选择培养液中无限繁殖（图12-1）。
HAT培养液选择杂交瘤细胞HGPRT：次黄嘌一般在融合24h后加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂，50×HAT贮存，用时取1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔，所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。一般认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进选择，可得到满意的筛选结果。50×HAT的成分为：H：5×10－3mol／LA：2×10－5mol／LT：8×10－4mol／L一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测筛选
杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为首选。
常用的方法有：
1.ELISA，用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
2.RIA，用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3.FACS（荧光激活细胞分类仪），用于细胞表面抗原McAb的检测。4.IFA，用于细胞和病毒抗原McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存
克隆化一般是指将目的抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆，可能会有数个甚至更多的克隆。要想将这些多个克隆细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于目的抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则目的抗体分泌细胞会被抗体非分泌细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比目的抗体分泌细胞的生长速度快，两者竞争的结果会使目的抗体分泌细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期地再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
（一）杂交瘤细胞克隆化方案
克隆化的方法很多，最常用的就是有限稀释法和软琼脂平板法。
1. 有限稀释法
（1）制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。
（2）阳性孔细胞的计数，并调整细胞数在（1～5）×103／ml。
（3）取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔，加A、B、C三排，为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔，加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
（4）培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
（5）第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
2. 软琼脂平板法
（1）软琼脂的配制含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640；1％琼脂水溶液，高压灭菌，42℃预热；0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成，置42℃保温。
（2）用上述0.5％琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
（3）按100个／ml、500个／ml或5000个／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
（4）1ml0.5％琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
（5）混匀后立即倾注于琼脂基底层上，置室温中10min，使其凝固，置于37℃、5％CO2孵箱中。
（6）4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
（6）检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
（二）杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞。每次克隆化得到的亚克隆细胞都十分保贵，因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞在培养过程中随时可能发生污染、抗体分泌能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则会因为上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法与其他细胞系的冻存方法一样，原则上每支安瓿应含细胞数1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。冻存液最好预冷，操作动作应轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至－70℃时可放入液氮中；或细胞管降至0℃后放－70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果用于大量生产，费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
（1）实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按（1～3）×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2～4点。待肿瘤长到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体，含量可达到1～10mg／ml。但采血量有限。
（2）腹水的制备
常规方法是，BALB／c鼠先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液体石腊，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠。用滴管收集腹水于试管中，一般一只小鼠可获得1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg／ml，这是目前较常用的方法。还可将腹水中的细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔，则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其作如下方面的鉴定：1.单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。如制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其他脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。又如制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其他细胞因子间有无交叉。2.McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类，则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在做双扩试验时，如加入适量的PEG（3％），将有利于沉淀线的形成。3.单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液中的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5.0×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。4.McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验和测相加指数的方法，测定McAb所识别的抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
六、影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长、环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有：
1. 污染 包括细菌、真菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最棘手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清。此外，其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，无菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
2.融合后杂交瘤不生长 在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：①PEG有毒性或作用时间过长；②小牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选；③骨髓瘤细胞污染了支原体；④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体（1）融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。（3）对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能是发生染色体丢失。Goding（1982）曾提出“三要”、“三不要”，是防止抗体停止分泌的有效措施。 三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管；要经常应用倒置显微镜检查细胞的生长状况；要定期进行再克隆。 三不要：不要让细胞“过度生长”，以防非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞；不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月；不要使未经克隆化的杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传代。
4.杂交瘤细胞难以克隆化 可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，则应在培养液中加HT。
举报/反馈