一文掌握小鼠动脉粥样硬化斑块定量评估

　　心血管疾病是现今人类死亡的首位病因，其背后的主要病理改变是动脉粥样硬化（atherosclerosis），表现为大中型动脉中缓慢脂质堆积形成斑块，并伴有慢性炎症反应。

　　「atherosclerosis」一词，最早由德国莱比锡病理学家 Marchand 于 1904 年正式提出。而在此之前，已有病理学家尸体解剖时在死者冠状动脉内发现沙砾状物质以及血管硬化、骨化，并提出这可能是造成心绞痛的原因。

　　随后，在 1913 年俄国病理学家 Nikolai Anitschkow 通过喂食富含胆固醇的葵花油，成功在家兔的大动脉诱导出粥样斑块病变，为动脉粥样硬化的动物实验研究打开了大门。

　　一、动脉粥样硬化小鼠模型

　　目前用于动脉粥样硬化研究的动物模型种类众多，包括小鼠、大鼠、兔、猪和非人灵长类等。每种动物模型各有其优缺点。与其他动物相比，小鼠体型小，繁殖速度快，近交系繁殖降低了个体差异，增强了实验结果的稳定性和可重复性。另外，基因编辑技术在小鼠中的广泛应用，使得靶向删除或敲入某个基因，对其进一步功能研究变得更为方便。

　　C57BL/6 是这些研究中最常用的近交小鼠品系，它被用作大多数转基因品系的遗传背景。野生型 C57BL/6 小鼠对动脉粥样硬化具有天然抗性，其循环中的胆固醇主要以 HDL-c 的形式存在，这与人类中的主要成分 LDL-c 显著不同，因此，即使在高脂高胆固醇饮食喂养下，野生型 C57BL/6 小鼠也不会形成明显的粥样斑块。

　　

　　图1 不同饮食下Apoe-/- 小鼠主动脉根部油红染色

　　A. Chow Diet B. 12108C, Research Diets

　　1992 年 Jane L. Breslow 与同事在胚胎干细胞中运用同源重组的方法建立了 Apoe 基因敲除（Apoe-/-）小鼠模型。ApoE 缺乏损伤了肝脏对于乳糜微粒的摄取，严重影响了正常脂质代谢。Apoe-/- 小鼠循环中胆固醇主要存在于 VLDL 颗粒中，即使喂食普通饲料，血浆胆固醇仍可高达 10~15mmol/l (400~600mg/dl)，4~6 周便可见单核细胞在血管壁黏附，10 周左右可观察到明显斑块（图 1A）。给予高脂高胆固醇饮食喂养后血浆胆固醇可进一步增高至 20~30mmol/l，粥样斑块的发生也更早更快（图 1B）。

　　另一种常用模型是 LDL 受体敲除（Ldlr-/-）小鼠，由 Ishibashi S. 与同事在 1993 年建立。LDL 受体识别载脂蛋白 ApoB100 和 ApoE，是肝脏摄取和清除循环中 LDL 的关键蛋白。Ldlr-/- 小鼠模拟了人类家族性高胆固醇血症的病理过程，需要高胆固醇饮食诱导动脉粥样硬化的发生。目前最常用的高脂高胆固醇饲料为 Western diet (D12079B; Research Diets)，其中脂肪供能比为 45%，含有 0.15% 胆固醇。另一种常用饲料是 D12108C，脂肪供能比为 40%，含 1.25% 胆固醇。由于其胆固醇含量更高，因此促动脉粥样硬化的作用也较 Western diet 更为显著。

　　在以上两种最为常用的基因敲除小鼠的基础上，又衍生出了更多的基因工程小鼠。例如，人类 APOB100 转基因 Ldlr-/- 小鼠 (HuBL 小鼠)，是将人类全长 APOB100 基因转入小鼠体内。HuBL 小鼠在普通饲料喂养下能够出现高胆固醇血症和动脉粥样硬化表型，并且其血浆中胆固醇以 LDL-c 为主，这使得 HuBL 小鼠相较于 Apoe-/- 小鼠和 Ldlr-/- 小鼠更加接近人类的脂质谱结构，同时也能够进一步在小鼠体内开展人类 apoB 的在体研究。

　　尽管小鼠和人类粥样斑块在结构上存在一定的相似性，但与人类不同的是，小鼠斑块极少发生破裂导致心肌梗死等血栓事件，对斑块稳定性和动脉血栓事件的研究有赖于新的动物模型。

　　小鼠模型的整条主动脉上均可形成粥样斑块，包括头臂动脉、颈动脉、锁骨下动脉等。同人类相似，这些斑块主要发生于动脉小弯侧和血管分叉处，可能与血流在此处形成湍流有关。由于粥样硬化病变的严重程度与血管部位有关，为了更加准确地评估病变的严重程度和干预效果，增强实验结果的可靠性和稳定性，使研究结果能够推广，规范统一的斑块评估策略必不可少。

　　对小鼠动脉粥样硬化斑块的评估通常分为两个水平：1. 大体标本油红染色，即取主动脉弓或全主动脉，经油红染色后评估斑块面积；2. 切片染色，将主动脉根部或头臂动脉、颈动脉等冰冻切片后，行油红、Masson、天狼星红或免疫荧光等染色。冰冻切片不仅能够评估斑块的大小，还能够对斑块组分进行进一步分析。

　　二、小鼠处死和标本收集

　　1. 麻醉取血

　　采用异氟烷（浓度 2%，流量 10ml/min，与不同麻醉机设备有关）吸入麻醉后，摘除一侧眼球采集血液，20 周龄雄鼠可收集 1ml 以上血液，室温静置 1~2 小时，待血液充分凝固后，3000 转 / 分，离心 10 分钟分离血清，-80℃保存备用。

　　2. 全身灌流

　　将小鼠仰卧位固定于解剖台，从肋弓下缘两侧向上剪开胸腔，将胸壁和胸骨、肋骨整个向上翻起，充分暴露心脏。在右心房剪开一小口，将连有输液器的针头自心尖部插入左心室，采用预冷的生理盐水或 PBS 进行全身灌流。全身灌流能够减少血细胞在血管内堆积，有利于下一步染色分析。注意观察，待右心房流出液体转为澄清透明，肝脏由红转白，提示灌流效果较好。

　　3. 组织采集

　　

　　图2 小鼠主动脉及其分支结构图

　　在体式显微镜（图 2A）下去除心脏和主动脉弓附近的气管、食管、胸腺以及多余脂肪组织，充分显示主动脉弓及其三大分支 —— 自左向右分别为头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉（图 2B-2C）。沿中线剪开腹壁，移除膈肌及腹腔内肝脏、脾脏、胃肠道、胰腺等器官，保留腹膜后的肾脏及脊柱旁的腹主动脉。在剪去肠系膜动脉时，一定注意将肠道提起，在远离主动脉处剪开，避免损伤腹主动脉。小心去除腹主动脉和肾动脉周围脂肪组织，显示完整的腹主动脉结构。自髂动脉分叉以下剪断，沿脊柱向上剪去主动脉的细小分支使其游离，在靠近肾脏处剪断肾动脉，在颈部将三根分支血管自远端剪断，最后，在靠近心脏位置将升主动脉剪断。

　　将心脏置于 4% 的甲醛或 10% 多聚甲醛中固定。根据研究目的，若计划行全主动脉斑块评估，直接将整个主动脉浸入甲醛固定；若仅行主动脉弓斑块评估，则在主动脉弓下方将血管截为两段，主动脉弓部分采用甲醛固定，其余部分液氮速冻用于后续 PCR 或 Western blot 分析。由于主动脉弓与降主动脉缺乏明显分界线，目前多数将降主动脉发出第一肋间动脉处作为二者分界。

　　三、主动脉大体油红染色斑块评估

　　将充分固定后的全主动脉或主动脉弓从固定液中取出，加入生理盐水或 PBS 清洗去除表面残留的固定液。由于脂肪组织可被油红染为亮红色而干扰斑块观察，染色前需要进一步在体式显微镜下使用精细镊去除血管外膜的脂肪组织，注意轻柔操作，避免损伤血管。

　　将 Vannas 弹簧剪自升主动脉断口处伸入血管管腔内，沿主动脉弓大弯侧向远端将主动脉弓及其三个分支纵向剖开至降主动脉处，然后沿小弯侧向远端纵向剖开整个主动脉。将剖开的主动脉内膜面朝上展开，用最小号的昆虫针或针灸针固定于黑胶皿上。

　　配置油红染液：称取油红 O 粉末 0.5g，加入异丙醇（98%）100ml，90℃水浴 1h，过滤后即为油红 O 饱和液，取饱和液和双蒸水按 3:2 混合，静置 10 分钟后过滤即为油红 O 工作液，饱和液及工作液均避光保存。

　　向黑胶皿中加入油红工作液将血管完全浸没，置于 37℃水浴锅中孵育半小时。弃去油红染液，加入 75% 乙醇分化 2 次，每次 5min，加入生理盐水或 PBS 洗去乙醇。

　　

　　图3 小鼠主动脉大体油红染色和操作器械

　　向黑胶皿中加入生理盐水或 PBS 浸没血管后拍照（图 3A-3B），采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件分别测量整个内膜和各个斑块面积，以斑块总面积除以整个内膜面积即为斑块的相对百分比。采用百分比能够消除小鼠体型差异所造成的影响。

　　全主动脉或主动脉弓大体油红染色能够定量评价发生粥样硬化的血管表面积，但忽略了斑块的厚度。因此，需要与主动脉根部切片染色相结合共同评价病变程度。

　　备注：1. 由于小鼠的血管管径较小，分离所使用的手术器械较为特殊，包括小号的精细镊和 Vannas 弹簧剪（图 3C）。2. 黑胶皿为正常玻璃培养皿底部包被了一层黑色橡胶样物质，可以用细针将血管固定于其上，并且在拍照时呈现黑色背景，与血管对比强烈。该皿也可使用蜂蜡等原料自制。3. 整个过程注意滴加 PBS 保持血管湿润。

　　四、动脉粥样硬化斑块冰冻切片

　　

　　

　　图4 小鼠主动脉根部冰冻切片方法示意图

　　将经过甲醛充分固定的心脏移入 25% 蔗糖 PBS 溶液中脱水 48 小时以上，观察到心脏沉在液体底部即为脱水完成。取出心脏，滤纸吸干表面水分，使用锋利的刀片沿与心脏长轴垂直方向切除心尖部 2/3（图 4A），将剩余部分切面向下置于冰冻切片包埋盒中，向其中加入 OCT 将组织完全浸没，将包埋盒置于冰冻切片机中冷冻。冻好的组织块可用锡箔纸包裹后 - 80℃冰箱保存。

　　将冰冻切片机温度设为 - 20℃，切片厚度设为 10μm。将冻好的组织块心室面朝外固定于样本托，将样本托安装在载物台上，调整刀片角度以保证切片方向与主动脉根部保持垂直。采用普通载玻片观察切片位置。最初切片上仅可见心肌组织，此时可每隔 200μm 留取一张切片显微镜下观察。随着切片位置逐渐靠近左室流出道，将观察间隔缩短为 100μm。当镜下观察到二尖瓣时，将观察间隔进一步缩短至 50μm。

　　保证切片方向真正与血管走行方向垂直对斑块定量极为关键。切面倾斜会导致对斑块大小的错误判断。据估计，仅仅 20° 的倾斜便会造成对斑块绝对面积接近 15% 的高估。而通过对距离主动脉窦不同部位的多个切片综合评估，能够降低这种切面倾斜所带来的误判。因此，为了能够更加准确的评价斑块大小，我们推荐采用以下切片方案。当镜下观察到第一个主动脉瓣出现时，该位置即为切片的「零点」。朝平行该瓣膜方向调整刀片角度，以使第二个瓣膜尽快出现。当第二瓣膜出现后，依同样方式调整刀片角度，以尽快出现第三瓣膜。刀片调整前后切片位置间距离不应超过 50μm。当三个瓣膜都出现后，从距离「零点」90μm 处开始收集切片于包被多聚赖氨酸的粘附载玻片上。每个样本留取 10 张切片，切片留取方式如图 4B 所示，其上所示数字为切片位置距离「零点」的距离。

　　除主动脉根部外，头臂动脉、颈动脉等也可行冰冻切片和染色，具体方法与

　　主动脉类似，需要尽可能保持切片方向与血管走行方向垂直，其应用相对较少，此处不再赘述。

　　五、动脉粥样硬化斑块切片染色与定量评价

　　对动脉粥样硬化病变程度的评估不应仅仅关注于斑块大小，对斑块结构的分析同样关键。在人类中，容易发生破裂的「易损斑块」往往具有大的坏死核和薄纤维帽，斑块中平滑肌细胞和胶原纤维含量较少，而炎症反应较重。尽管在小鼠模型中斑块破裂现象极为少见，对于斑块中胶原、平滑肌、巨噬细胞、T 细胞以及粘附因子如 VCAM-1、ICAM-1、炎症因子如 IFN-γ 等组分的分析对于评价斑块的稳定性仍具有一定意义，可以通过对主动脉根部多张冰冻切片进行不同染色来检测这些组分。主动脉根部粥样斑块常用染色方法如下。

　　

　　图 5-1 小鼠主动脉根部油红和Masson染色

　　1. 油红 O 染色

　　油红 O（Oil Red O）是一种脂溶性偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，能特异性地使组织和细胞内中性甘油三脂、脂质以及脂蛋白等染色。动脉粥样硬化斑块中由于富含脂质，能够被油红 O 染为红色，因此常常用于斑块大小和脂质含量的评价。

　　染色完成后，光镜下观察拍照，图像采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件分别计算管腔面积和斑块面积，将斑块总面积除以管腔面积即为斑块的相对大小。另外，也可根据拍照时的标尺计算斑块的绝对面积，单位通常为 mm2 ；或者采用软件计算图像中红色部分面积，除以斑块总面积，即为斑块中脂质含量百分比（图 5-1A）。左右冠状动脉通常从距离主动脉窦 250μm 左右的部位发出，该位置同时也是斑块最严重的部位，因此，该处切片常常作为代表图像用于结果展示。

　　2. Masson 三色染色

　　Masson 三色染色是经典的评价胶原纤维的染色技术，能够区分胶原纤维和肌纤维，染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，可用于评估粥样斑块中的胶原含量。

　　染色完成后，光镜下观察拍照，采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件计算图像中深蓝色部分面积，除以斑块总面积，即为斑块中胶原含量百分比（图 5-1B）。通常认为，斑块中胶原相对含量越高，提示斑块越稳定。

　　3. 天狼星红染色

　　同 Masson 三色染色目的相同，天狼星红染色也用于对胶原含量的评价。在普通光学显微镜下，心脏血管等组织中的胶原纤维被染成红色，肌纤维被染成黄色。在偏振光显微镜下，能够进一步区分各型胶原。在偏振光显微镜下，Ⅰ 型胶原纤维呈红色或黄色，排列紧密，具有强双折光性；Ⅱ 型胶原纤维色彩多样，疏松网状，弱双折光性；Ⅲ 型胶原纤维呈绿色，细纤维，弱双折光性；Ⅳ 型胶原纤维为淡黄色，弱双折光性。

　　

　　图 5-2 小鼠主动脉根部天狼星红染色

　　染色完成后，普通显微镜（图 5-2A）或偏振光显微镜（图 5-2B）下观察拍照，采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件计算图像中胶原面积，除以斑块总面积，即为斑块中胶原含量百分比。通常认为，斑块中胶原相对含量越高，提示斑块越稳定。

　　4. 免疫荧光

　　

　　图 5-3 小鼠主动脉根部冰冻切片免疫荧光染色

　　采用针对特定蛋白的一抗和相应标有荧光基团的二抗对斑块中的某些成分进行免疫荧光染色，以评估相应抗原在斑块中的表达情况。其中最常用的包括抗 α-SMA，用以显示平滑肌细胞，和抗 CD68 抗体，用以显示巨噬细胞。

　　染色完成后，在荧光显微镜下观察拍照，采用 Image-Pro Plus 或 ImageJ 等软件计算图像中相应颜色荧光面积，除以斑块总面积，即为斑块中相应抗原百分比。例如图 5-3 中，绿色荧光显示平滑肌细胞内的 α-SMA（图 5-3A），红色荧光显示巨噬细胞表面抗原 CD68, 分别用绿色和红色荧光面积除以各自斑块面积，即为斑块内平滑肌细胞和巨噬细胞的相对含量。

　　除上述常用染色方法外，HE 染色、TUNEL 荧光染色、针对不同抗原的免疫组化染色等，也被用来对斑块的大小和组分进行评价。按照本文第四部分所述的切片留取方法，每只小鼠留有 10 张主动脉根部不同水平的冰冻切片，能够满足多种染色需求。根据实验目的合理选择多种不同染色方案对斑块进行综合全面评估，对动脉粥样硬化的病理研究具有重要意义。

　　六、总结

　　基因工程小鼠是目前最常用的动脉粥样硬化动物模型，为人类探索疾病的病理机制、寻找治疗靶点、开发新型药物做出了巨大贡献。动脉粥样硬化的发生发展是一个慢性过程，即使在小鼠体内，造模也常常需要花费数月时间。造模完成后，如何准确评价病变程度又是一个挑战。小鼠主动脉的各个部位均可形成粥样斑块，不同部位斑块大小和组成存在显著差异。为了更加准确地评估病变的严重程度和干预效果，增强实验结果的可靠性和可重复性，参考既往发表文献，本文提供了一套规范的取材、染色和定量流程，希望对于相关领域的研究者们能起到一定的帮助。

　　参考文献：

　　1.Daugherty, A., et al., Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res, 2017. 121(6): p. e53-e79.

　　2.Centa, M., et al., Quantification of Atherosclerosis in Mice. J Vis Exp, 2019(148).

　　3.Shu, S., et al., The role of monocyte chemotactic protein-induced protein 1 (MCPIP1) in angiotensin II-induced macrophage apoptosis and vulnerable plaque formation. Biochem Biophys Res Commun, 2019. 515(2): p. 378-385.