气雾剂型纳米抗体，预防或治疗新冠病毒的利器？

　　新冠疫情爆发后，科研人员反应迅速，沉着应对，不到一年的时间就在新冠病毒的基础研究、药物筛选和疫苗开发等领域取得突破性进展。在众多研究成果中，中和抗体疗法因出现在感染新冠病毒的美国总统特朗普的治疗方案中而广为人知。中和抗体是一种靶向病原体并阻断病原体入侵细胞的特异性免疫球蛋白，可作为新冠病毒的特效药物。目前美国食品和药物管理局（FDA）已批准生物制药企业礼来和再生元开发的新冠中和抗体紧急使用授权，此外还有10余种新冠中和抗体正处于临床试验阶段。

　　在新冠中和抗体开发热潮中，有一类短小精悍又武艺高强的抗体引起人们的兴趣，这类抗体就是天然存在于大羊驼、骆驼和相关动物体内的纳米抗体。纳米抗体是一种类抗体免疫蛋白，由单一抗体重链组成，分子量仅为IgG抗体的10%。同IgG类常规抗体相比，纳米抗体的优势包括水溶性和稳定性更好，组织穿透性更强，更易于进行蛋白工程化设计，可以低成本大规模生产，还可以制成气雾剂通过吸入或鼻喷等方式用于预防或治疗疾病。

　　2020年12月22日，美国国立卫生研究院（NIH）的科学家发表研究结果称，他们从一只名叫Cormac的美洲驼体内分离出一种可高效中和新冠病毒的纳米抗体NIH-CoVnb-112，未来此抗体有潜力以吸入或鼻喷方式预防或治疗新冠肺炎。此抗体的开发流程及评价结果介绍如下：

　　1. 研发人员用商业化新冠S1蛋白(Cat.# S1N-C5255)免疫美洲驼，随后分离出外周血单核细胞（PBMC）构建噬菌体表面展示文库，此文库中含有超过108个纳米抗体克隆（图1. A）。接下来研发人员采用一种有趣的竞争法对纳米抗体克隆进行筛选：将商业化人源ACE2（Cat.# AC2-H52H8）固定在分析管上，然后将纳米抗体克隆和生物素化RBD（Cat.# SPD-C82E9）的混合物加入到分析管中，能够结合生物素化RBD且能阻断RBD/ACE2结合的纳米抗体将存在于溶液中，而结合生物素化RBD但无法阻断RBD与ACE2结合的纳米抗体将被固定于分析管上，最后再用链霉亲和素包被的磁珠可将溶液中结合生物素化RBD的纳米抗体克隆分离出来，因此用这种方法筛选到的纳米抗体均具有阻断RBD与ACE2结合的能力（图1. B）。

　　图1. 新冠纳米抗体开发流程

　　2. 研究人员对分离出的几百种纳米抗体克隆进行测序，发现存在13种独特序列的克隆，命名编号从NIH-CoVnb-101到NIH-CoVnb-113。利用大肠杆菌表达这13种纳米抗体，并通过生物膜干涉技术检测纳米抗体与RBD蛋白（Cat.# SPD-C82E9）的亲和力，其中NIH-CoVnb-112与RBD的亲和力最高，解离常数为4.9nM（图2）。

　　图2. 生物膜干涉技术检测新冠纳米抗体与RBD的亲和力

　　3. 体外竞争性实验表明，筛选出的纳米抗体能够抑制RBD同ACE2的结合，其中NIH-CoVnb-112的EC50值最低，为1.11nM（图3）。

　　图3. NIH-CoVnb-112可有效抑制ACE2/RBD结合

　　4. 新冠病毒RBD区域发生突变可能会帮助病毒逃逸宿主免疫应答或使中和抗体失效。研究人员对NIH-CoVnb-112与三种RBD突变蛋白（N354D/D364Y, V367F, W436R；Cat.# SPD-S52H3, SPD-S52H7, SPD-S52H4）的结合进行检测，发现与原型RBD蛋白（Cat.# SPD-C52H3）的亲和力无明显区别，并且NIH-CoVnb-112抑制RBD原型和突变蛋白与ACE2结合的EC50值也非常接近。这说明NIH-CoVnb-112或许能够有效抑制含有这三种RBD突变的新冠毒株感染（图4）。

　　图4. NIH-CoVnb-112可结合RBD突变体并有效抑制ACE2/RBD突变体结合

　　5. 分别利用生物膜干涉和酶联免疫法检测NIH-CoVnb-112与SARS-CoV-1 RBD的结合，发现NIH-CoVnb-112不结合SARS-CoV-1 RBD，因此这株纳米抗体具有种属特异性。

　　图5. NIH-CoVnb-112不结合SARS-CoV-1

　　6. 通过圆二色谱法对NIH-CoVnb-112的稳定性进行研究，发现只有当温度升高到74.4°C时，此抗体的结构开始去折叠，而当温度恢复正常时，73%的抗体能够重新折叠，说明这株抗体的稳定性极高。

　　7. 纳米抗体分子量小且稳定性高，通常可制成气雾制剂，因此研究人员尝试用商业化喷雾器将NIH-CoVnb-112制成气雾剂。在SDS-PAGE和凝胶层析实验中，气雾化前后的抗体纯度和溶液均一度非常接近，接着研究人员又通过假病毒实验证实气雾化前后的NIH-CoVnb-112抑制表达Spike蛋白的假病毒侵染过表达人源ACE2细胞的EC50值接近。以上实验结果说明NIH-CoVnb-112对雾化过程并不敏感，且能够有效阻断假病毒对宿主细胞的感染（图6）。

　　图6. 雾化NIH-CoVnb-112性质稳定，可有效抑制假病毒感染细胞

　　这项研究中鉴定出的纳米抗体NIH-CoVnb-112稳定性高，可制成喷雾剂，且中和活性强，具有成为预防或治疗新冠肺炎药物的潜力。值得一提的是，ACRO为这项研究中的多个过程提供了关键的蛋白试剂，如免疫美洲驼使用的S1蛋白，进行抗体克隆筛选的生物素化RBD蛋白，RBD/ACE2竞争性实验中使用的ACE2蛋白等，具体产品列表如下所示：

　　在进行实验前，研究人员对ACRO的新冠相关蛋白产品的纯度和活性进行了验证，均获得满意的结果（图7）。

　　图7. NIH研究人员检测ACRO蛋白纯度及活性结果

　　由此可见，ACRO高品质的蛋白产品为这项研究的成功奠定了坚实的基础。ACRO也一直坚持着“从靶点蛋白开始，为更好生物医药”的初衷，致力于提供靶向治疗药物、诊断试剂、疫苗研发过程中所需的靶点抗原及其他关键试剂和相关服务。

　　ACRO蛋白产品助力新冠相关研究

　　ACRO针对新冠病毒开发的相关蛋白产品具有纯度高、批间差小的特点，产品经过严格的体外验证、细胞活性验证和假病毒验证，可应用于新冠病毒诊断、疫苗和治疗性抗体的各个阶段。已有多个课题组将ACROBiosystems蛋白产品应用于其新冠病毒相关的研究中，相关成果发表于Cell、Nature、Science等期刊。

　　部分文献引用产品

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