术中快速免疫组织化学染色在中枢神经系统肿瘤诊断中的应用

　　目前传统术中快速诊断还是通过病理医师对HE染色或是甲苯胺蓝（toluidineblue）染色（细胞学印片）的切片进行形态学观察做出判断，但其诊断准确率不是很高，只有约50～96%。本实验室既往曾经回顾了近年来10000例冰冻切片诊断，并与最终石蜡切片诊断进行比对，分析其诊断符合率及误诊率，结果发现中枢神经系统疾病冰冻切片诊断的误诊率较其它脏器相对较高，国内文献报道误诊率在1.6—9.6%。

　　结合病例资料分析，我们认为主要有以下几方面原因：

　　从我们分析的结果可以看出，误诊率最高的肿瘤主要是是血管外皮瘤、血管母细胞瘤、淋巴瘤、及少见的软组织肉瘤，其次为少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、转移癌。其中胶质瘤，淋巴瘤和转移癌的诊断的确立对神经外科术中处理方式极为关键而显得尤为重要。

　　而在中枢神经系统肿瘤中鉴别不典型的胶质瘤、淋巴瘤和转移癌往往困难，因为这几种肿瘤在冰冻切片上细胞密度、核异型性、核分裂像以及坏死形态学上具有相似性。加之脑肿瘤富含水和脂肪成分，较其他组织更为“软”，所以高质量的冰冻切片不易制备，也导致诊断相对困难，所以有时病理医师难以在术中短时间内根据HE染色切片给出准确诊断和鉴别诊断。

　　很长一段时间以来，病理学家和肿瘤学家都在寻找能辅助术中快速诊断的方法。免疫组化染色（IHC）在肿瘤诊断中是一种非常有用的技术，然而传统的实验过程需要120分钟以上才能完成，因此在术中应用是不实际的。在过去几年中，人们积极地探索了一些快速的IHC方法，如基于AC电场促进抗原-抗体反应的R- ICC（快速免疫细胞化学）、基于罗氏Ventana BenchMark Ultra 平台的自动快速冰冻染色等。基于微波技术的R- ICC（快速免疫细胞化学）应用于胰腺癌或胆管癌术中腹腔灌洗液细胞学检测已有报道。也有研究应用R- ICC（快速免疫细胞化学）技术进行细胞角蛋白染色来判断乳腺癌前哨淋巴结细胞学印片中有无癌组织转移。随着Novodiax ihcDirec技术出现，相关快速免疫组化方法(R-IHC)的建立，使得术中应用成为可能。Novodiax ihcDirec技术是将多聚HRP直接连接到一抗上，缩短了免疫组织化学的反应步骤，整个染色过程仅仅耗时20分钟，帮助病理医师得到客观诊断依据，从而使术中进行免疫组化染色成为可能。

　　为了测试这项新技术在中枢神经系统的应用，我们选取了胶质瘤、淋巴瘤和转移癌这几个常见且误诊率高、误诊对临床处置影响大的病例进行术中快速免疫组化染色辅助进行鉴别诊断。冰冻切片采取5μm 切片进行HE染色和快速免疫组化染色（包括手动和自动两种染色方式）。同一肿瘤标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，制成常规切片进行HE染色和标准免疫组化染色。手工法快速免疫组化需将冰冻切片在固定液中（25ml冰醋酸，100ml 37%甲醛，375ml甲醇）及时固定至少30秒。然后参照试剂盒说明书步骤进行，整体时间约为10min左右。（鉴于实际工作中，冰冻值班人员要兼顾制片、行快速免疫组化及实验稳定性，综合考虑，本实验室进行了开放式自动免疫组化仪行相关Novodiax ihcDirec技术机染法的设计与尝试）。行机染快速免疫组化需预先把固定液、通用IHC封闭液以及一抗（PolyHRP -GFAP/LCA/CK-pan）加注到专用试剂瓶中并在自动免疫组化仪系统中注册然后进行染色。注册然后进行以下步骤（编程设定Leica Biosystem为模型，见表1）。