抗体工程改造研究∣盘一盘 FcRn“新生儿”Fc受体
在全球生物制药急速扩张的大背景下，抗体及抗体工程药物在疾病的诊断，治疗和预防方面所占的比重迅速增长。自1986年第一个单克隆抗体药物上市以来，经过30多年的研究和发展，抗体药物以其高度特异性和疗效确切的特点，在肿瘤自身免疫，代谢，病毒感染等疾病领域显示出独特的优势和广阔的应用前景。
长期以来，抗体药物不可避免的高研发成本所产生的昂贵售价并不很亲民，并且相对频繁的注射给药也给患者带来诸多不便。抗体半衰期是抗体药物代谢动力学的关键，因此，延长抗体半衰期成为抗体工程改造的重点之一。抗体半衰期的延长不仅可以提高药物利用率，减少给药频率，并且可以降低治疗费用。本期小编给大家分享，基于FcRn功能开发的药物研究(延长抗体药物半衰期和自身免疫疾病治疗)。
一、关于抗体
抗体是由B淋巴细胞对外来分子或抗原刺激后产生的Y型免疫球蛋白，其包含两个完全相同的抗原结合片段(fragment antigen binding，Fab)和一个可结晶片段(fragment crystallizable， Fc)。人体内表达的免疫球蛋白(Ig)主要有5种：IgM、IgA、IgD、IgG、IgE。其中，血清中含量最多的免疫球蛋白是IgG，也是抗体药物的主体。
抗体是免疫系统的核心组成部分，可以预防和控制病原体的传播，同时对再次感染提供长期保护。
二、抗体药物重要作用机制
抗体的结构决定其作用机制，抗体的基本结构是由两条重链(Heavy chain)和两条轻链(Light chain)，通过链间的二硫键连接而成，呈“Y”字型。
Fab段
其中，Y型结构上面的两个臂为Fab段(VH和VL)(见图1)可以识别游离分子(如VEGF、TNF等)和细胞表面的受体(如CD20、CD19等)，达到对外来入侵物(病毒，细菌等)及自身异常细胞如癌细胞的特异性识别，进而调控如癌细胞抗原相关的下游信号通路，从而抑制癌细胞生长，诱导癌细胞分化和凋亡。
Fc段（CH2和CH3）
Fc段决定抗体的效应功能，巨噬细胞、NK细胞等细胞表面的Fc受体为对免疫球蛋白Fc部分C末端的受体。免疫球蛋白(Ig)与抗原结合后，抗体的Fc段变构，与细胞膜上的Fc受体结合，产生各种生物效应，包括抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及补体依赖的细胞毒性作用(CDC)等进一步提高单克隆抗体的疗效。
IgG受体主要有FcRn和FcγRs。其中，FcγRs /C1q与可结晶片段(Fc)区域(图1)相互作用的位点位于下铰链上的CH2(绿色矩形)；FcRn与Fc区域相互作用的位点位于CH2、CH3的界面(黄色矩形)。
图1：免疫球蛋白Y整体结构示意图及其与FcγRs/C1q和FcRn的结合区域
此外，FcRn与IgG的结合呈pH依赖性(pH dependence)，这是FcRn实现IgG的跨膜转运及维持血浆IgG水平稳态的基础。
三、基于FcRn功能开发的药物设计
新生儿Fc受体(FcRn)是一个非常优质的载体膜蛋白，广泛参与了体内各种生物学及免疫过程。基于FcRn的药学研究主要集中与融合蛋白，IgG的Fc段工程化改造以及用于靶向FcRn药物递送应用的研究和FcRn抗体的研发。
Fc与FcRn以pH依赖的方式相互作用，可以减缓IgG的降解，延长其血清半衰期；抗体Fc区域的缺失也大大缩短了其血清半衰期，削弱了其药效作用。
除了半衰期评估，FcRn作为靶点的潜力也相当巨大，主要因为FcRn的高亲和力尤其对IgG介导自身免疫性疾病造成有害影响。靶向FcRn，抑制FcRn循环可使IgG分解代谢增强，导致整体IgG和致病自身抗体水平降低，有望降低IgG引起的自身免疫异常，从而达到治疗自身免疫疾病的作用。
FcRn的结构与功能
FcRn(neonatal Fc receptor，新生儿受体)是一种位于细胞膜表面的IgG抗体受体，其蛋白结构和MHC-I类分子类似，其结构包含由α链(α1,α2和α3)和β2微球蛋白组成的异二聚体；FcRn可以与IgG以及白蛋白结合，但是结合的位点不同，分别位于α链的内测和外侧(图2)。
图A 图B
图2：FcRn与IgG及白蛋白结合的结构示意图
由图2(A/B)结构示意图可见：人IgG1(红色)通过其Fc端CH2–CH3域与FcRn的α2域(绿色)和β2M(灰色)的N端相结合。人血清白蛋白(紫色)在其他结合域与FcRn结合。平衡条件下，FcRn与IgG以2:1的比例结合，不平衡条件下，FcRn与IgG以1:1的比例结合；白蛋白在其他位点与FcRn以1:1的比例结合。由此可见，FcRn与IgG和血清白蛋白的结合位点并不相同，因此FcRn与IgG结合不会受到血清蛋白的干扰。
FcRn与抗体半衰期的关系
IgG在人体内半衰期长达2-4周，影响半衰期主要归因于FcRn介导的再循环机制，而这种机制是通过IgG的Fc片段和血清白蛋白与FcRn的pH依赖性结合而实现。在酸性条件下(pH6.0-6.5)，FcRn结合IgG，在中性及弱碱性条件下(pH7.0-7.5)发生解离(图3)。
图3：FcRn对IgG的循环示意图
内皮细胞通过形成内吞小泡，将IgG摄取后形成酸化内体。IgG与FcRn结合形成IgG-FcRn复合物。IgG-FcRn复合物通过再循环内体转运到细胞表面，由于细胞外血液的pH值为微碱性pH7.4左右，IgG-FcRn复合物发生解离，IgG重新释放至血液循环中，通过这种受体介导的再循环机制，FcRn有效保护IgG避免在溶酶体中降解，从而延长IgG的半衰期。而酸化内体中未与FcRn结合形成IgG-FcRn复合物的IgG，则在溶酶体内发生降解。应用FcRn对IgG的循环机制延长抗体药物在体内的半衰期是目前应用较广泛的方法。
基于上述的循环机制，对抗体的Fc序列进行改造可以进一步优化抗体的药代动力学特征。可以采用氨基酸点突变，噬菌体展示，酵母展示，细胞展示及计算机辅助设计等方法，构建和筛选Fc突变体，优化pH依赖性的Fc-FcRn相互作用，使其在pH6.0条件下结合力更强，而在pH7.4条件下Fc能从FcRn上迅速解离，避免被溶酶体等降解，实现改造的目的。
2018年FDA批准了Fc工程化突变体药物Ravulizuma-cwvz，是一种补体C5抑制剂，由Alexion制药公司开发，用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。该药物是通过对Eculizumab中加入了两个结构变化，在Fc区进行两个氨基酸替换，增强了抗体对人FcRn的亲和力，以创造一种新的长效抗体。Eculizumab需要每2-3周静脉输注一次，增加了输注负担和相关不良事件,而Ravulizumab半衰期长达42天, 患者只需每8周接受1次静脉注射治疗。此外，Xencor的LS变体 (M428L/N434S)，pH6.0 时与FcRn的亲和力提高了11倍, 突变体M252Y/S254T/T256E(YTE)与hFcRn的结合亲和力提高了10倍。使用这些突变技术，MEDI-524-YTE在食蟹猴体内半衰期延长近 4倍。抗体药物motavizumab-YTE在人体内的半衰期可达100天。由此可见，通过FcRn对IgG的循环机制，对抗体的Fc序列的改造可以很大程度上延长药物半衰期，对患者用药可以减少其用药次数。
通过上述机制的启发，新为医药根据FcRn对IgG的保护机制，利用ASyNaL纳米抗体筛选平台(噬菌体展示技术)，对Fc段进行改造，构建Fc突变体文库，通过FcRn对Fc突变体文库进行筛选，获得了一系列与FcRn亲和力相对较高的Fc突变体，在不同的pH值条件下，通过BLI测定其亲和力。最后筛选到多个高亲和力的Fc突变体。为后续新为医药所筛选到的其他药物延长其半衰期做准备。
四、基于FcRn功能开发的药物临床应用
FcRn延长药物治疗半衰期
目前，除了上述讲到的Ravulizuma-cwvz，motavizumab-YTE等，还有一些基于FcRn途径延长药物半衰期的临床应用。
01、Etanercept
Etanercept(依那西普)是首个被批准用于治疗类风湿关节炎(RA)的特异性抗细胞因子疗法，由TNF受体和IgG1 Fc片段组成(图4)。因此，依那西普可以结合自由利用TNFα和β，从而降低这些炎症因子的水平。利用一个免疫球蛋白的Fc区域作为融合元件以使构建的二聚体受体得到更长的血清半衰期。除依那西普外，开发用于治疗糖尿病的dulaglutide和albiglutide以及凝血因子与IgG1的Fc或白蛋白融合，将血友病治疗的半衰期提高了3-5倍。
图4：Etanercept与其他TNF抑制剂结构的比较
02、VRC01-LS
VRC01是用于HIV-1预防的IgG1广泛中和性单克隆抗体(bnMAb)，VRC01-LS在VRC01的Fc区进行了两个氨基酸突变(M428L和N434S)，目的是延长血清半衰期。在小鼠模型中发现LS突变导致IgG-FcRn结合增强，但不影响与FcγR的结合，因此不损害Fc介导的效应因子功能，如抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)，在I期临床试验(NCTO2599896)中，VRC01-LS在血清中的半衰期比VRC01增加了近4倍。值得注意的是，VRC01-LS对猿人免疫缺陷病毒(SHIV)直肠内感染的保护作用优于VRC01。这些发现表明，FcRn结合的修饰不仅提供了一种机制，增加了血清半衰期，也增强了黏膜定位，提供免疫保护。因此，增强FcRn功能的突变可以增加被动免疫策略的效力和持久性，以预防HIV-1感染。
03、Satralizumab
Satralizumab是一种人源化靶向IL-6R的单抗，并利用了新的“抗体回收技术”。Tocilizumab每周皮下注射162mg，Satralizumab改变了Fc区氨基酸序列，将一个酪氨酸残基突变为组氨酸残基，允许更长的抗体循环时间，从而降低了给药频率，每月皮下注射120mg。
靶向FcRn缩短内源性抗体半衰期
（治疗自身免疫疾病）
利用FcRn对IgG的循环机制不仅能延长抗体半衰期，还能够缩短内源性抗体半衰期。许多自身免疫性疾病是由IgG自身抗体介导的，包括重症肌无力(MG)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)、天疱疮和原发性免疫性血小板减少症。IgG自身抗体在MG中的致病作用是导致神经肌肉接点的受体和蛋白质导致神经肌肉信号转导失败。因此通过利用IgG回收途径，FcRn抑制剂与患者体内的内源性致病性IgG竞争FcRn结合，在存在FcRn抑制剂的情况下，摄入的IgG无法与FcRn结合；未结合的内源性致病性IgG被溶酶体降解(图5)。可以满足降低致病性IgG和提供更有针对性的治疗方法的迫切需求。下面介绍一些于FcRn途径治疗自身免疫疾病的临床研究(图7)。
图5：FcRn抑制剂如何破坏IgG的回收
01、Efgartigimod
Efgartigimod(ARGX-113)是首个且目前唯一获FDA批准的FcRn拮抗剂，是人源IgG1 Fc改造后的片段，在中性及酸性环境中与FcRn的亲和力大大增强，也是首个获批的专门针对减少致病性IgG的疗法，为攻克MG提供了全新的治疗手段。在一项 I 期研究中，单次给药IgG水平降低50%-75%，多次给药IgG水平降低25%左右，白蛋白水平未见影响；一项 II 期试验显示，75%的患者获得了快速而持久的疗效；除此之外还被用于治疗免疫性血小板减少性紫癜，寻常型天疱疮，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
02、Rozanolixizuma
Rozanolixizuma(UCB-7665)是来自布鲁塞尔生物技术公司UCB Biopharma的一种皮下给药的人源化抗人FcRn IgG4P-单克隆抗体，能特异性结合人FcRn，阻断FcRn与IgG的相互作用，抑制IgG循环，诱导致病性IgG自身抗体的清除， II 期临床总IgG和抗-AChR抗体滴度平均降低68%，目前正处于 III 期研究中。
03、Nipocalimab
Nipocalimab(尼卡利单抗，M-281)是强生公司开发的一种IgG1型抗FcRn单抗，可以在细胞内(酸碱度为6)及细胞外(酸碱度为7.5左右)与FcRn高亲和力结合，降低IgG水平高达90%，总蛋白和血清白蛋白水平轻微降低。2022年初，强生公司申报的I类新药Nipocalimab注射液拟被CDE纳入突破性治疗品种，适应症为全身型重症肌无力(gMG)。
图6：Nipocalimab注射液在CDE网突破性治疗申请公示详细信息
04、Batoclimab
Batoclimab(巴托利单抗，HBM9161/RVT1401)是来自和铂医药的一种完整的人源单克隆抗体，与FcRn结合，阻断FcRn-IgG相互作用以加速自身抗体的降解，治疗各种致病性IgG介导的自身免疫疾病。该产品曾在中国被纳入突破性治疗品种，目前正在开展多种适应症的临床研究。
05、Orilanolimab
Orilanolimab(SYNT001)是一种人源化、亲和力成熟的IgG4单克隆抗体，含有S241P突变，可在中性和酸性pH值下结合FcRn，已被研究用于治疗gMG。
图7：FcRn靶向药物结构
由此可见，围绕着FcRn介导的IgG循环机制，既可以延长抗体的半衰期也可以缩短抗体的半衰期，除了以上例举的多款产品，未来随着FcRn生物学功能研究的不断深入，FcRn在药物开发中的前景也逐渐被广泛认可。我们衷心希望，越来越多的基于FcRn开发的产品能够在临床试验中获得验证，早日为患者带来疗效更好、安全性更佳的治疗选择。
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