头秃！读完硕士还不懂的免疫共沉淀，要点都在这儿

　　常有科研人抱怨，读完硕士还掌握不好免疫共沉淀实验，对科研已经完全失去了信心！在此，丁香实验对免疫共沉淀实验进行讲解，助力大家顺利科研。

　　一、实验原理

　　免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础，广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。

　　具体的实验原理是：如果细胞内两蛋白（A、B）有直接或间接的相互作用时，那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将 A 蛋白沉淀下来，在细胞内与 A 蛋白直接相互作用的 B 蛋白或与其间接相互作用的 C 蛋白能一起被沉淀下来。

　　最后，通过 WB 实验检测沉淀中是否存在 B 或 C 蛋白来确定 B 或 C 蛋白与 A 蛋白的相互作用。

　　二、实验用途

　　检测 A、B 蛋白在体内是否相互结合

　　分离与 A 蛋白相互作用的蛋白复合物

　　三、材料与仪器

　　实验材料：

　　293T 细胞（以该细胞做转染为例）、转染质粒（Flag-A, HA-B) 、flag抗体、2Ⅹloading buffer、PBS、Flag-beads、1XTBST、5 X SDS loading buffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 A 和 B、RIPA 裂解液；

　　实验仪器：

　　磁力架、金属浴、RIPA 裂解液旋转混合仪、WB 实验相关设备。

　　四、实验步骤

　　1. 细胞的铺板与转染

　　提前一晚将 293T 细胞铺板至 6cm 皿中，铺板量以达到相应的转染试剂要求为准；

　　用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染 2 皿细胞：flag 空载+HA-B；flag-A+HA-B；每质粒 2 微克。

　　2. 免疫沉淀

　　转染 24 小时后，收取细胞，每皿加入 500 μL 裂解液，收集细胞至 1.5mL EP 管中，在冰上超声破碎细胞；

　　超声好后，4℃，12,000g，离心 30 分钟，取 400 μL 上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作总蛋白并加入等体积的 2 X loading buffer；

　　将 400 μL上清加入用裂解液清洗了 3 遍的 beads 中，加入 0.3～0.5 μg flag抗体，4℃ 孵育 3～4 小时；

　　4℃，2,000g，离心 3 分钟，去除未结合的液体，留下 beads 沉淀，用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀 3 次，每次 5 分钟；

　　最后一次去除清洗液，往沉淀中加入 60 μL 2 X loading buffer，和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。

　　3. Western Blot检测

　　通过 SDS-PAGE 分离样品，利用全蛋白样品作为对照，检测 flag-A 和 HA-B 蛋白是否发生结合。

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　　五、实验注意事项

　　对于内源的 Co-IP 检测应该用 10cm 皿来培养目的细胞，并维持较好的生长状态；

　　如果该实验用于新蛋白的鉴定，应注意抗体重链和清链的影响；

　　该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的；

　　阴性有较强的条带，这有可能是结合较弱或清洗不干净导致的；

　　内源的 Co-IP 实验结合较弱或者不结合。

　　看完上述免疫共沉淀的实验步骤，小伙伴们还头秃吗？

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　　策划：静静菌

　　配图：丁香实验设计团队