抗PD

　　有关抗体与受体结合能力及模型结构，一直是我的短板之一。正好有人询问到相关知识点，有必要搞清楚，才不至于以其昏昏使人昭昭。

　　在阅读本文前有必要在回顾下之前有关抗体的基础知识

　　鼠源抗体到全人源抗体的历史演变，纳米抗体、单域抗体、双抗等释义（一）

　　鼠源抗体到全人源抗体的历史演变，纳米抗体、单域抗体、双抗等释义（二）

　　抗体融合蛋白、双特异性抗体分子构建及分类

　　那开始正式我们本次的求知之旅，在抗PD-1单抗获批以前，基本上肿瘤抗体药物选用的基本都是IgG1亚型，期冀Fc段介导的ADCC等效应清除抗体结合的靶细胞-肿瘤细胞，Her2这种肿瘤细胞高度特异性表达的靶点就成为首选。而随着PD-1等免疫检查点的发现，从T细胞免疫的角度来考虑抗肿瘤治疗，是不希望抗PD-1单抗Fc段介导ADCC等效应杀死结合的靶细胞-T细胞，所以常采用IgG4这种低ADCC效应的亚型。而抗CTLA-4单抗和抗PD-L1单抗，则采用IgG1亚型和IgG2亚型。

　　

　　随着抗体工程技术的提升，不同的国内Biotech企业采取了不同的方式来优化抗体亚型。百济神州的替雷利珠单抗采用的是IgG4variant 变异型 来取代普遍采用的IgG4S228P。康方生物的派安普利单抗是采用了Fc段改构的IgG1亚型。不能的技术派带来的新型抗PD-1单抗，有赖于临床数据的检验。本文就已纰漏的基础性科研文章来罗列不同抗体与受体结合能力的论述，以飨读者。

　　——IgG1抗体结构与功能——

　　

　　图1. 完整的人IgG1结构

　　使用Discovery Studio来生成完整的人IgG1的结构，由于PDB文件中没有铰链肽区域的坐标，没有展示出来。其余结构都有展示出来了。重链（H）以蓝色显示，轻链（L）为青色，红色为N-聚糖。Fv（右上角）带有抗原结合位点。V L互补决定区（CDR）为黄色；V H CDR为红色。Fc（右下角）相对于抗体旋转，以更好地显示N-聚糖的位置（红色）。

　　

　　图2. 抗体药物的多种作用机制

　　抗体药物的多种作用机制。抗体药物如IgG1型的，通过特异性结合癌细胞上的靶点和结合效应细胞表面的Fc受体，可激活免疫效应器功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）和补体介导的细胞毒性（CDC）。抗体还可以通过靶向癌细胞表面的可溶性配体或其受体，阻断它们之间的相互作用。

　　——抗CTLA-4单抗的结构与功能——

　　由于CTLA-4靶点相较于PD-1靶点的复杂，目前获批的药物只有Ipilimuab（伊匹木单抗），为IgG1亚型。与伊匹木单抗几乎同期上临床的阿斯利康研发的Tremelimumab（替西木单抗，为IgG2亚型）则一直还未获批上市，但最近Tremelimumab联合度伐利尤单抗接连获得III期阳性结果，获批在即。两者都是通过阻断淋巴结内CTLA-4靶点才发挥作用的，但近年来，

　　有关CTLA-4靶点的机制争议一直不断，在CTLA-4靶点机制争议,能否去除Fc段功能一文中有过梳理。本文进一步整理这两款CTLA-4抑制剂与CTLA-4靶点结合晶型，来夯实詹姆斯的经典阻断理论。

　　Ipilimumab

　　

　　图3. CTLA-4:ipilimumab复合物的结构

　　(A):凹面CTLA-4前表面由CC′（米色）和FG（MYPPPY环；深紫色）链组成，被ipilimumab的CDR所包埋。CDR、FG和CC′链分别染色显示：LCDR3（橄榄色）和LCDR1（青色）与G链形成氢键相互作用。HCDR2（粉红色）和HCDR1（浅灰色）与F和C链紧密结合，参与氢键和疏水相互作用。HCDR3（洋红）插入CTLA-4前表面的中心，并专门参与疏水相互作用。

　　(B):CTLA-4分子，以彩虹色彩表示（N端到C端从蓝色到红色的转变），前后链分别标记为白色和黑色。在抗原受体中保守的G-链β凸起是以红色显示。

　　(C): CTLA-4绕垂直轴相对于B旋转90°，突出显示凹面前表面，CDR的大致位置表示为相应颜色的箭头（如A中所用）。

　　

　　图4. ipilimumab的作用机制

　　(A): CTLA-4和CD28之间的相同残基为蓝色，CTLA-4序列中的插入物为红色；两者都映射到CTLA-4结构（黄色）。

　　(B): CTLA-4和CD28之间的相同残基为蓝色，CD28序列中的插入物为红色；两者都映射到CD28结构（黄色）。请注意，Myppy循环曲面轮廓是相似的。

　　(C): B7-2（浅蓝色）与MYPPPY环表面的相互作用模式。

　　(D):B7-1（粉红色）与MYPPPY环表面的相互作用模式。

　　(E): CTLA–4和ipilimumab相互作用的模式。

　　(F):根据每个复合物中的CTLA-4成分,呈现CTLA-4:B7-2和CTLA-4:ipilimumab结构的叠加。

　　这些叠加表明ipilimumab和B7配体竞争CTLA-4上重叠的结合表面。

　　Tremelimumab

　　

　　图5. tremelimumab与CTLA-4复合物的晶体结构

　　CTLA-4（紫色）在复合物中的以带状表示，tremelimumab的 Fab片段同样染色显示（重链：蓝色，轻链：青色）。在a中，CTLA-4（灰色）/B7-1（橙色）复合物（PDB代码1i8l）叠加在CTLA-4/tremelimumab复合物中的CTLA-4分子上混合功能区/曲面表示。在b中，CTLA-4（灰色）/B7-2（橙色）复合物（PDB代码1i85）叠加在CTLA-4中的CTLA-4上/具有混合色带/曲面表示的tremelimumab复合体。

　　小结

　　从上述结果来看，ipilimumab和tremelimumab正好在B7相互作用域内与CTLA-4结合，介导空间位阻，起到阻断CTLA-4与B7的结合。有利的维护了詹姆斯的经典CTLA-4靶点阻断理论。

　　——抗PD-1单抗的结构与功能——

　　PD-1靶点的机制倒没有争议，各家不同的产品主要在于Fab端的受体亲和力和Fc段的改构上，以求差异化。以替雷利珠单抗发表的一篇基础文章为例。

　　替雷利珠单抗

　　

　　图6. 抗PD-1单抗结合模型

　　纳武单抗和帕博利珠单抗主要结合在活动的N-端和环形结构表位，而抗体技术改构的替雷利珠单抗与环形结构表位没有结合作用，替雷利珠单抗结合PD-1b-折叠带的正前方，与PD-L1结合表位高度相似，具有高亲合力。这是替雷利珠单抗的差异化展示。

　　另一款Fc段改构去除了ADCC、ADCP效应，采用IgG1亚型的派安普利单抗的结合模型，在2021年ESMO会议上也纰漏了基础研究数据。

　　派安普利单抗

　　

　　图7.派安普利单抗结合模型

　　晶体衍射分析显示派安普利单抗可以与人PD-1的N-58糖基化位点结合，这可以使得派安普利单抗与PD-1的解离更加缓慢。因此，与纳武利尤单抗(2.43E-04/s)和帕博利珠单抗(2.80E-04/s)相比，派安普利单抗(9.51E-05/s)显示出更慢的解离速率。

　　相信随着抗体工程技术的不断优化，抗体类药物会不断得到优化，更好的惠及临床患者。

　　备注：

　　N-聚糖：连接在蛋白质肽链中天冬酰胺残基侧链酰胺氮上的寡糖。此类寡糖通常均有一个核心的五糖和类似结构的外周糖链。单克隆抗体上的 N-聚糖结构对维持抗体构象和稳定性有重要的作用Fc 段的 N-聚糖可以稳定 IgG 抗体的 CH2结构域

　　参考文献：

　　Almagro JC, Daniels-Wells TR, Perez-Tapia SM and Penichet ML (2018) Progress and Challenges in the Design and Clinical Development of Antibodies for Cancer Therapy. Front. Immunol. 8:1751. doi: 10.3389/fimmu.2017.0175.

　　Udupi A. Ramagopala et al. Structural basis for cancer immunotherapy by thefirst-in-class checkpoint inhibitor ipilimumab.

　　www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1617941114.

　　S.H.Lee, et al.,Yong-Seok Heo,2020 BiochemBiophys Res Comm,527: 226.

　　2O Penpulimab, an IgG1 anti-PD-1 antibody with Fc-engineering to eliminate effector functions and with unique epitope and binding properties.DOI:https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.280.

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