用于单抗药物生产的动物细胞大规模培养技术发展迅速

　　摘要 近年来，用于单抗药物生产的动物细胞大规模培养技术发展迅速。此领域的技术进展集中在个性化培养基开发，工艺条件优化等方面。本文总结了用于提高重组抗体表达水平的常用方法，以及细胞培养工艺对抗体药物"关键质量属性"（聚体、降解、糖基化修饰、电荷变异等）的诸多影响。此外，细胞培养工艺在产业化过程面临着工艺放大与技术转移，定性研究与工艺验证等实际问题。未来大规模细胞培养工艺的开发，将进一步借助动物细胞的组学研究成果和新兴的"过程分析技术"。

　　关键词 重组抗体 大规模细胞培养 培养基优化  工艺开发

　　引言

　　目前，多种表达系统均可实现重组抗体的异源表达，但是抗体药物的产业化制备，始终以动物细胞大规模培养工艺为主[1]。1986年首个治疗性抗体OKT3TM上市之初，动物细胞表达水平普遍不足100mg/L。经过近三十年间发展，业内用于重组抗体生产的动物细胞培养工艺，无论细胞培养密度，还是抗体表达水平均提高五十倍以上。流加培养工艺中细胞密度可达1~2×107cell/mL，日均产量200mg/L/day以上（最高可达700mg/L/D），最终收液的容积产率可达3-5g/L（最高达13g/L[2]），培养体积可达20，000L（Lonza, Portsmouth/NH-facility）[3]；灌注培养工艺中细胞密度可达2×108cell/ml，抗体容积产率最高达25~40g/L（Percivia公司XD?灌注系统[4]）。以上行业技术水平的飞速提升，既源于上游细胞系构建技术的突破[5]，也得益于细胞大规模培养工艺的日臻成熟。尤其是后者综合培养基开发，工艺优化，结合新型生物反应器的使用，实现了动物细胞的高密度、高表达培养，满足了临床上对于抗体药物"公斤级"产能的需求。

　　1动物细胞培养的过程参数与培养模式

　　动物细胞的体外培养，涉及生物反应器的物理参数（温度、pH、DO、DCO2等）、培养基的营养成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等）的消耗，以及自身代谢产物（乳酸、氨、重组蛋白等）的积累与生理生化参数（细胞密度、活性，能荷等）的变化。作为重组抗体生产的"细胞工厂"，上述过程参数的改变会直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。比如：当乳酸（58 mM）、渗透压（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）参数超过其相应的阈值，细胞活性和抗体产量均会明显下降[6]。目前，业内已经对于细胞培养过程参数进行了深入的研究，在动物细胞大规模培养中下述参数的控制也已成定式（见表一）。

　　表1 动物细胞培养的过程参数与控制范围[7, 8]

　　Table 1 The parameter and control for animal cell culture process

　　 

　　参数

　　控制（或测定）范围

　　检测手段

　　控制策略

　　物理参数

　　温度

　　32~38℃

　　铂温度电极

　　PI/PID程序控制

　　pH

　　6.8~7.2

　　pH电极

　　通CO2或流加碱液

　　DO

　　20~60%

　　DO电极

　　搅拌转速、通气量等

　　DCO2

　　5~25% （40~180mmHg）

　　DCO2电极

　　渗透压

　　270~330 mOsm/kg

　　冰点渗透压检测仪

　　流加培养基及流加策略

　　营养物质

　　葡萄糖

　　0~10g/L

　　生化分析仪、酶试剂盒

　　葡萄糖限制性流加

　　谷氨酰胺

　　0~10mM

　　谷氨酰胺限制性流加

　　氨基酸

　　0~10mM

　　HPLC

　　流加浓缩培养基

　　核苷酸

　　0~10mM

　　HPLC

　　代谢产物

　　乳酸

　　0~50mM

　　生化分析仪、

　　酶试剂盒

　　使用半乳糖替代葡萄糖

　　氨

　　1~10mM

　　使用丙酮酸、谷氨酸替代谷氨酰胺

　　生理参数

　　细胞密度与活性

　　105~108/ml ; >70%

　　台盼蓝染色-血球计数板法，活细胞技术仪，生物量电极等

　　ATP

　　0.5~5pg/cell

　　HPLC1)、SDS-PAGE2)、

　　抗体蛋白

　　抗体浓度

　　0.1~10g/L

　　ELISA3)、protein A HPLC4)、western-blot5)等

　　纯度

　　聚体，降解等

　　SEC- HPLC6)

　　糖基化水平

　　G0、G1F、G2F、Man5等

　　HPLC

　　电荷变异

　　酸性变异、碱性变异

　　iCIEF7) 、IEF8)、CEX9)、HPLC

　　注： 1) High Performance Liquid Chromatography；2) Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis；3) Enzyme-linked Immunosorbent  Assay；4) Protein A Affinity Chromatography；5) Protein Immunoblot；6) Size Exclusion Chromatography；7) Imaged Capillary Isoelectric Focusing; 8) Isoelectric Focusing；9) Cation Exchange Chromatography；

　　1.1 流加培养方式及优化策略

　　目前上市的重组抗体中绝大多数（如：EnbrelTM、HerceptinTM、RituxanTM、SynagisTM）是采用流加（Fed batch）培养工艺生产，这主要由于与之配套的生物反应器（搅拌罐、气升罐等）制造成熟，可线形放大（最大至20,000L），操作简单等原因。但是，流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题。因此，流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上[2]2][9] [10] [11]，其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养基，用于补充易耗成分，降低副产物积累[12] [13]。

　　1.2 灌注培养方式及优化策略

　　灌注培养模式（Prefusion）下，反应器几乎可实现"恒化器"培养效果，细胞密度、蛋白产量可较流加模式提高数倍[14] [15]。但是灌注培养细胞截留需特殊装置，工艺放大存在难度，其产业化应用的经济性尚存争议[16] [17]。目前，只有少数抗体（如：ReoProTM、RemicadeTM、SimulectTM、SimponiTM、StelaraTM等）及易降解的重组蛋白（凝血因子）等使用该工艺。灌注培养工艺优化，主要集中在灌注培养基及灌流速度上[18]。 其优化原则是通过降低灌流速度，提高培养基的利用率和产物的容积产率。

　　此外，控制流加灌注工艺（controlled fed prefusion）同时具有流加工艺和灌注工艺的优点。该工艺对易产生代谢废物的营养进行限制性流加。根据细胞摄氧量的变化，流加氨基酸以满足高密度细胞的营养需求。[19]

　　用于提高重组抗体表达水平的方法

　　动物细胞的高密度培养，有赖于合适的培养基以及适宜的反应器环境。因此，旨在提高重组抗体表达的工艺开发，主要集中在"个性化培养基"的开发以及过程参数的优化上。上述研究通常需要借助小型化反应器，如传统的三角瓶、孔板，转管（spintube）等。近年，新型自动化小规模反应器（BioLectorTM、SimCellTM、Micro-24TM,ambrTM等）[20]不断出现，此类装备不仅能模拟反应器的pH、DO、培养基流加等控制条件，而且能够实现试验条件的通量筛选，大大加速了细胞培养工艺开发的进程。如： SimcellTM可同时使用180个微型反应器（650ul）进行工艺条件筛选[21]。Micro-24TM可在孔板规模（5ml）对3L反应器pH，DO，温度等不同条件进行模拟[22]。

　　2.1培养基优化方法

　　早期的动物细胞培养基中常含有胎牛血清或小牛血清。近年工业用培养基的开发趋势，已经转向无蛋白 （PF）、无动物源（ADCF），甚至化学成分明晰培养基（CD）[23]。此外，抗体生产企业在培养基开发过程中，还应充分考虑培养基成本（通常<20 ＄/L）、生物安全性与质量稳定性（避免动物源血清、植物源蛋白水解物）以及下游纯化工艺的兼容性等问题[24]。

　　哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，如： NS0细胞的生长依赖于外源性胆固醇，杂交瘤细胞、CHO细胞多为谷氨酰胺营养缺陷型。此外，即使基于同一宿主细胞所构建的的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调"个性化培养基"的概念，即：生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。下述方法在用于培养优化均有提高重组抗体表达的报道。

　　2.1.1组分滴定法

　　组分滴定法（Component titration）是通过设计培养基组分的浓度梯度，来确定其最优浓度。由于动物细胞用培养基成分复杂（常含有70种组分以上），且存在"协同效应"。所以，该方法只适用优化培养中的个别组分（如胰岛素、水解物[25]、生长因子等）。

　　2.1.2培养基混合法

　　培养基混合法（Media blending）是通过对成分已知的原型培养基进行不同比例混合。借助DOE（Experiment design expert）软件进行试验设计与分析，快速确定最优培养基配方[26]。目前市售培养基优化试剂盒均是据此原理。

　　2.1.3消耗组分分析法

　　消耗组分分析法（Spent media analysis），通过对批式培养过程中各组分的消耗情况进行分析，及时补充易消耗组分，调整流加策略。该方法由于检测手段所限，主要用于葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等组分的优化[27, 28]。

　　2.1.4化学计量分析法

　　化学计量分析法（Stoichiometric Analysis）利用简化的数学模型，建立葡萄糖、氨基酸，维生素与细胞生物量与重组蛋白合成，以及能量代谢之间化学计量关系。据此进行初始培养基、流加培养基以及流加策略优化，可减少乳酸、氨的生产，该方法在上世纪九十年代提高重组抗体产量至2.4g/L [29, 30] 。

　　2.1.5理性培养基设计法

　　理性培养基设计（Rational Culture Media Design），综合上述三种培养基优化方法。先对大量培养基候选物及混合配方进行筛选，利用最初确定的基础培养基进行批式培养，分析培养基中易消耗组分，据此设计流加培养基和流加策略。最后，利用组分滴定法确定流加培养基其他添加物（水解物）的最适浓度。最后，优化过的基础培养基、流加培养基及补料策略，在迷你反应器上进行验证。这也是大多数CRO公司（Sigma、BD等）开发定制培养基的主要方法[31] [32] [33] [34]。

　　2.1.5系统培养基开发法

　　系统培养基开发（Systematic Approaches），是将培养基成分分为氨基酸、维生素、核苷酸等若干组，首先判定对细胞表达影响较为显着的组别，再针对该组别进行重点的成分优化。[35] [36]

　　2.2 两相培养与代谢转化

　　绝大多数重组蛋白的生产采用"两相培养工艺"（biphasic culture process），该工艺中"生长期"与"生产期"采用完全不同的控制策略，如降温、调节pH，改变流加策略等（见表2）。此工艺中细胞的代谢状态发生明显的变化，称之为"代谢转化现象"（metabolic shift）即：生长期细胞代谢旺盛，产生大量乳酸，而进入生产期后，细胞生长受到抑制，乳酸产量随之变小，直至消耗。

　　2.3 促进异源蛋白表达的小分子物质

　　某些小分子化合物可以通过改变细胞周期，促进重组蛋白的表达（见表2）。直接在培养基中添加这种物质，是提高目的蛋白产率的简便方法。此类物质中丁酸钠（NaBu）和二甲基亚砜（DMSO）应用最多。

　　表2 细胞培养中用于提高重组抗体表达的方法和物质

　　Table 2 The summary of methods and compositions used for improving recombinant antibody expression in cell culture process

　　提高表达的策略

　　常用方法

　　作用原理

　　应用

　　培养基优化

　　谷氨酰胺、葡萄糖限制流加或使用半乳糖、谷氨酸替代

　　降低乳酸、氨等副产物生产

　　[11] [12] [37]

　　补充易消耗氨基酸

　　丰富培养基营养、添加水解物

　　[30, 38]

　　5磷酸腺苷 （AMP）

　　ATP前体，能有效抑制细胞生长

　　[39]

　　丙酮酸、苹果酸、柠檬酸

　　提高三羧酸循环效率

　　[40]

　　补充铁离子载体（辅酶Q10、亚硒酸、硫酸铁和柠檬酸钠）

　　增强细胞胞内转铁效率

　　[41] [42] [43]

　　补充磷酸盐，磷酸盐缓冲液（PBS）

　　有助于核酸、细胞膜等的合成

　　[44] [45]

　　补充硫酸铜

　　减少自由巯基，降低抗体聚体含量，减少乳酸生成

　　[46, 47]

　　两相工艺与代谢转换

　　降低温度

　　细胞周期控制在在G0/G1期，提高抗体蛋白转录水平等

　　[48] [49]

　　降低pH

　　促进细胞代谢转换

　　[38] [50] [51]

　　提高渗透压

　　渗透压胁迫下，细胞的代谢、转录、信号传导等均发生变化。

　　[52] [53]

　　小分子化合物

　　丁酸钠、戊酸、丙戊酸、丙酸等

　　组蛋白去乙酰化酶竞争性抑制剂，抑制细胞生长。

　　[54-57]

　　DMSO

　　调节细胞周期至G1期

　　[58]

　　雷帕霉素

　　调节细胞周期至G1期

　　[59]

　　地塞米松

　　增加融合蛋白的唾液酸含量，减少聚体形成

　　[60] [61]

　　氢化可的松

　　降低细胞生长速率，提高细胞活性，和谷氨酸消耗速率

　　[62]

　　芳香羧酸、乙酰胺、异羟肟酸、戊酸

　　提高异源基因转录水平

　　[63]

　　细胞培养工艺对重组抗体质量的影响

　　作为生物大分子的重组抗体，同时具备聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、异构体、二硫键错配等多种变异形式[64]。由"细胞工厂"异源表达的重组抗体，其绝大部分质量变异与生产细胞对重组蛋白的翻译后修饰作用直接相关，随着FDA、EMEA对于抗体药物关键质量属性（Critical quality attributes）的定义与要求，细胞培养对重组抗体质量影响的研究日益深入[65]。（见表二）。

　　Table 3 The changes of recombinant antibody quality attribute in cell culture process and impact on antibody drug clinical efficacy

　　表3 细胞培养过程中重组抗体易发生的质量变化以及对临床效果的影响[65] [66] [67]

　　重组抗体质量变异

　　产生原因

　　临床效果

　　共价聚体

　　二硫键的错配、酪氨酸氧化易形成共价聚体

　　具有免疫原性，静脉注射发生过敏反应

　　非共价聚体

　　抗体分子间的疏水键结合形成非共价聚体

　　降解

　　铰链区易发生化学键断裂

　　降低抗体分子的效应功能等。

　　生产细胞中含有多种蛋白酶可降解全抗体分子

　　二硫键还原造成H2L、H、L等多种形式降解；抗体分子内部形成三硫键等

　　糖基化变异

　　NS0、sp/0细胞能产生NeuGc型唾液酸、Gal-a1,3-Gal等非人源糖基化形式

　　可引起严重的免疫反应。

　　NANA唾液酸修饰半乳糖苷末端

　　提高抗体药物的抗炎活性

　　G0/G1/G2等多种形式的半乳糖修饰

　　改变抗体药物的CDC效应功能

　　岩藻糖（FUT）修饰、甘露聚糖（Man5）修饰

　　影响抗体药物的ADCC效应功能

　　电荷变异

　　抗体分子结构修饰会造成携带电荷的差异

　　影响抗体在体内的组织停滞和血液清除

　　氨基酸变异

　　目的基因变异，转录差错等

　　NA