成功进行ChIP染色质免疫共沉淀实验的7个技术方法技巧

　　您是ChIP新手或是想改进实验结果？辉骏生物在下文介绍的7点的技术提示，将帮助您实现成功的染色质免疫共沉淀ChIP实验！

　　ChIP 是一种允许分析蛋白质与活细胞中染色质的相互作用（转录因子）的技术。

　　ChIP 提供有关染色质结构和与处于不同功能状态的基因结合的因子的信息。

　　ChIP 方法涉及蛋白质-DNA 交联。

　　对分离的粗染色质进行超声处理以产生小片段，通常平均大小为 300-1000 bp。

　　蛋白质特异性抗体用于免疫沉淀（下拉）染色质片段。

　　结合感兴趣蛋白质的 DNA 区域体内。

　　鉴于越来越多的证据表明染色质结构在调节基因表达中起决定性作用，ChIP 允许同时研究基因调控的结构和功能方面。 以下是辉骏生物相关的提示摘要，可帮助您优化 ChIP 实验。

　　1. 细胞/组织分离

　　2. DNA-蛋白质交联在其染色质结合位点稳定靶蛋白

　　此时可以停止 ChIP 协议并在 -80°C 下保存

　　3. 细胞裂解提供进入染色质的途径

　　4. 染色质碎裂（超声）

　　此时可以停止 ChIP 协议并在 -80°C 下保存

　　5. 免疫沉淀 (IP)/使用特异性抗体下拉染色质片段

　　6. 反向交联从 DNA 片段中分离抗体靶向蛋白

　　7. DNA片段的纯化和净化

　　8. DNA 分析：PCR、qPCR、微阵列、测序

　　温度很关键。 在 4°C 下进行细胞裂解。

　　保持样品冰冷并使用冰冷缓冲液。

　　交联时间和甲醛浓度都很重要。

　　请注意：使用多聚甲醛时，请确保它是新鲜制备的（最终浓度为 1%–1.5%）。

　　交联的持续时间是关键，可能导致交联不足或过度交联

　　

　　避免组织悬浮液中有大碎片。

　　使用切割的移液器尖端确保组织的精细均质化。

　　确保超声仪探头不与管壁接触。

　　增加超声处理步骤的数量以获得更好的染色质剪切； 但是，避免增加每个步骤的时间（或功率），因为这可能会使样品过热并导致抗原性丧失。

　　在超声波仪中加入冰以避免样品过热。

　　最好不要将染色质超声处理到小于 500 bp 的片段大小（进行琼脂糖凝胶电泳以确定染色质大小）。

　　请注意：不同的细胞类型可能有不同的最佳 DNA 片段化。 优化超声时间和振幅以获得最佳的 DNA 片段化。

　　准备用于 ChIP 中染色质定量分析的输入样品

　　辉骏生物：ChIP染色质免疫共沉淀流程图

　　IP 分数代表稀释和预清除 ChIP 的分数。 它用于涉及目标抗体或对照抗体的免疫沉淀步骤。

　　每个 IP 反应使用大约 25ug DNA

　　每 25ug DNA 使用 1-10ug 抗体

　　一些抗体可能允许与裂解物在室温下进行短时间孵育； 然而，一般来说，在 4°C 下孵育过夜会增加信号和特异性。

　　

　　准备珠子； 如果使用蛋白 A 和蛋白 G 珠，混合等体积

　　在 RIPA 缓冲液中多次洗涤珠子混合物

　　阻止珠子以防止非特异性结合

　　将磁珠添加到样品中进行 IP 反应，并在 4°C 下孵育过夜

　　

　　为每个 ChIP 实验准备阳性和阴性对照

　　使用已知（阳性）和未知（阴性）基因组区域的反应作为实验对照

　　

　　通常，在 95 °C 下孵育 15 分钟就足以诱导反向交联（破坏蛋白质-DNA 复合物）。

　　一些样品需要在 65 °C 下进行长达 16 小时的蛋白酶 K 处理，这有助于肽裂解。

　　> 使用不同的洗涤缓冲液（低盐和高盐、LiCl 和 TE 缓冲液）。

　　> 使用商业纯化柱时，在洗涤步骤后检查柱是否完全干燥，因为任何残留的水分都会抑制洗脱。

　　> 确保将洗脱缓冲液直接放在硅胶膜上并使其吸附至少一分钟。

　　> 从库存中准备新的解决方案以避免污染。

　　> 样品中显示的微弱 PCR 信号或没有 DNA 扩增可能是由于 PCR 扩增区域跨越无核小体区域的引物结果不足。

　　> 请注意：使用不同的引物条件和稀释度测试基因组 DNA 的引物对。 标准/输入 DNA 的使用将决定引物的功效。

　　> 确保 PCR 反应中有足够的 DNA，并且您的 PCR 条件是最佳的。 如果需要，可以在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

　　> 为避免重复之间的差异，请为所有样品添加相同数量的蛋白质 G/A-琼脂糖或磁珠。 确保珠子在移液时悬浮良好。

　　> 虽然阳性对照中没有产物，但请确保 IP 反应中有足够的染色质或抗体。

　　> 确保优化 IP 孵育时间。

　　> 完成蛋白质 G/A 珠子中染色质的洗脱。 最佳洗脱温度为 65℃，并经常混合以保持珠子悬浮在溶液中（约 10 分钟）。

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