盘点影响免疫组化染色结果的因素

　　01前言

　　免疫组化技术的发展和各种特异性抗体的出现，帮助对疑难肿瘤进行明确诊断，作为目前病理科常规的辅助诊断技术，免疫组化的临床应用已成为公认，随着精准个体化医疗时代，比如肿瘤免疫治疗，免疫组化也成为伴随诊断的重要手段之一，发挥重要作用。

　　免疫组化染色流程复杂，其中从样本准备处理-切片准备-染色流程-结果判读都可能影响最终的诊断结果；小赛以免疫组化14个步骤计算，按照每个步骤可能有两种不同的选择，计算出免疫组化结果可能出现16384种结果，但实际实验步骤中，可能存在更多的变量。

　　

　　免疫组化的染色结果与病理诊断息息相关，免疫组化染片结果也会影响判读，小赛今天就跟大家盘点下影响免疫组化的因素；

　　02对照设置

　　分享影响免疫组化染色原因之前，先跟大家简单分享下免疫组化对照设置的必要性；免疫组化实验步骤复杂，如果没有辅助信息佐证下，很难百分百确定每次染色的结果都是准确可靠的。因此，设置对照的目的在于验证染色结果可靠。

　　免疫组化染色对照设置一般分为：阳性组织对照、阴性组织对照；

　　阳性组织对照

　　目的： 用于确认染色流程无误；有效的抗原修复条件：缓冲液、温度、时间；试剂滴加无误；试剂反应条件：孵育温度时间正确合适；

　　方式：每一轮的检测，都应当使用阳性组织对照，推荐和待检标本置于同一张玻片上，也可以单独在一张玻片上。

　　Tips：

　　1. 用作阳性对照的组织，应当和待检测组织有完全相同的实验步骤处理过程：如样品固定、脱水、浸蜡、包埋、切片及染色流程。

　　2.如果阳性对照组织没有显示预期结果，则同一张玻片上（或者同一轮）的检测结果应当视为无效。

　　3.应当使用中等强度的阳性组织，其原因在于这类组织可以更好的反应染色方法是否导致过强或者过弱的结果（如果中等强度的阳性组织难以获取，也可以使用弱阳性的组织作为对照。但应尽量避免使用阳性过强的组织做对照）。

　　4. 对于HER2检测，应当使用中等阳性强度的IHC 3+组织作为对照，如有条件，应当明确对照组织基因扩增状态，也可同时键入IHC 2+组织，以提供更准确的质控。

　　阴性组织对照

　　目的：用于评估抗体的特异性；

　　方式：使用不含待检抗原的组织；每一轮次的检测中，都应当使用阳性组织对照，可以和待检标本置于同一张玻片上，也可以在一张单独的玻片上。

　　Tips：

　　1. 阴性组织对照，同样需要和待检组织有完全相同的处理过程。

　　2. 如果阳性对照组织没有显示预期结果，则同一张玻片上（或者同一轮）的检测结果应当视为无效。

　　03抗原修复

　　离体组织一般需要经过10%中性福尔马林固定和后续的石蜡包埋处理，以存放更长的时间，福尔马林固定在固定组织形态的过程中，也改变了组织中蛋白的结构，造成抗原决定簇的修饰，从而影响抗原与其特异性一抗结合，导致免疫组化染色出现“假阴性”的实验结果。

　　在免疫组化实验过程中，需要对组织进行抗原修复，以暴露蛋白的抗原决定簇；当前使用的方法有两种:酶修复和热修复（HIER），以提高靶标蛋白阳性检出率，提高免疫组化实验标准化。

　　修复方式

　　1. 酶消化修复

　　酶修复的作用机制可能在于暴露因固定导致的抗原决定簇的封闭，从而以增强抗原和抗体结合，但目前对固定液中甲醛与蛋白的反应详细机制仍存在未知，酶消化修复的具体机制仍然未知，只有少数抗体选择酶修复方式。

　　酶消化修复主要影响因素

　　消化酶种类：蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶

　　孵育温度：室温、37℃

　　孵育时间：5-40min不等；

　　2. 热修复

　　在一定pH值的盐缓冲液条件下，加热打开了组织因固定液引起的封闭和交联，使抗原决定簇重新暴露出来。加热修复由于其方便性与较好的可行性，在当前实际工作中被广泛适用。

　　影响热修复因素：温度和时间，一般温度越高，需要的时间越短；

　　微波法：96℃， 20min

　　直接加热法：100℃，10min

　　水浴锅法：100℃，20min

　　高压锅：120℃，5min

　　真空加热法：10min

　　影响热修复因素：pH值

　　实际工作中常用：pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 9.0的Tris-EDTA缓冲液；

　　前者使用广泛，但有一些研究（NordIQC）显示，高pH值对于许多抗原有更好的修复作用，因此后者的使用也逐渐增多；

　　高pH值时，高压高温修复容易导致组织脱片、修复过度、细胞形态受损，因此在目前使用压力锅的方案中，常见使用pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液。

　　影响热修复因素：组织和玻片的粘附程度

　　热修复对于组织和玻片的粘附程度要求比较高，对于进行IHC染色的玻片，使用粘附性能更好的玻片作为载体。

　　04其他常见问题分析

　　切片包括阴性对照片均着色

　　1、一抗浓度过高，或抗体孵育时间过长或温度过高；

　　2、组织封闭不当、封闭时间短；

　　3、洗涤次数和洗涤时间太短；

　　4、DAB变质或显色时间过长；

　　5、一抗变质或特异性差的多克隆抗体；

　　6、干片；

　　对照切片和待检切片均不着色

　　1、未按程序添加试剂或漏加；

　　2、检测系统与一抗种属不匹配；复染、脱水和封片剂与显色系统不匹配，缓冲液与检测系统不匹配；

　　3、抗体失效；

　　4、抗体浓度、孵育时间或温度不足；

　　5、孵育时玻片放置不停，抗体流失导致孵育不足；

　　6、抗原修复时间短；

　　7、修复过度，破坏抗原决定簇；

　　8、DAB显色时间短，底物失效；

　　9、显色底物配置不合格，失效；

　　10、阳性对照片选择不适当；

　　阴性对照片未染色，阳性对照和待检切片呈弱阳性

　　1、固定方式不当；

　　2、抗体保存不当或失活；

　　3、抗体浓度、作用时间和温度不足；

　　4、残留缓冲液稀释一抗浓度；

　　5、修复方法不合适（不足/过度）

　　6、显色底物配置不合格，显色液失效或显色时间短；

　　7、实验体系及辅助试剂不匹配；

　　8、组织切片抗原本身表达低；

　　切片不干净

　　1、缓冲液清洗不充分；

　　2、DAB显色液保存不当，引入杂质；

　　3、封片透明剂引入杂质；

　　4、固定时间太长，色素沉积；

　　5、苏木素引入杂质；

　　苏木素染色无或染色浅

　　1、苏木素染液过期；

　　2、染色时间短；

　　3、复染后分化时间长；

　　4、返蓝时间短；

　　苏木素染色与DAB显色对比弱

　　1、显色底物配置不合格，显色液失效或放置时间太久，推荐现配现用；

　　2、显色作用时间短导致显色浅；

　　3、苏木素染液浓度过高，染色时间长，导致苏木素蓝色过强；

　　胞质和核染色定位不当

　　1、一抗浓度过高；

　　2、二抗非特异结合；

　　3、抗原修复过度；

　　切片呈弱阳性

　　1、干片；

　　2、抗体浓度低，孵育时间短，温度低；

　　3、缓冲液或显色液不当；

　　4、载玻片粘合剂过厚；

　　切片出现非特异染色

　　1、封闭不当；

　　2、抗体特异性差，交叉结合；

　　3、抗体浓度过高，孵育时间过长或温度过高；

　　4、显色液配置保存不当；

　　5、组织坏死；

　　6、切片太厚；

　　7、未充分洗涤；

　　阳性片显色正常，待检片无阳性，呈假阴性

　　1、固定液选择、配置，浓度不当导致组织固定差；

　　2、组织固定、处理不当，固定时间过长、浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失；

　　3、待检组织抗原含量低，待检方法灵敏度低；

　　染色不均匀

　　1、脱蜡不干净；

　　2、抗体或显色时间太少，不均匀；

　　3、DAB配置不合格；

　　4、孵育未水平放置，混匀不当；

　　5、非即用型抗体混匀不当；

　　6、抗体稀释液过期；

　　脱片

　　1、玻片质量问题；

　　2、切片质量差，组织不平；

　　3、组织坏死；

　　4、固定时间温度不当；

　　5、抗原修复高压时间过长；

　　6、前期组织处理，如固定、脱水包埋等处理问题；

　　7、洗涤剧烈；

　　参考资料：

　　[1]刘勇,杨海玉.国际特设专家委员会建议:诊断免疫组化阳性对照标准化[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(01):1-3.

　　[2]丁会珍,刘丹丹,金贻铎.免疫组织化学检测阳性对照的应用现状与进展[J].诊断病理学杂志,2020,27(07):499-501+504.

　　[3]谭卫峰,刘庆猛,何平生.免疫组化质量控制的标准化管理[J].中国现代医生,2013,51(31):134-136+139.

　　[4]张卫琴.免疫组化技术在病理诊断中的应用[J].安徽医药,2012,16(11):1700-1702.

　　[5]河南病理质控中心. http://www.hnqc-pathology.com

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