「它」笑了，我哭了，做 WB 怎么这么难呀？

　　科研人最怕见到的两种微笑，一个是 ddl 前导师脸上关心的微笑，还有一个是 WB 条带上出现的微笑。

　　

　　

　　图片来源：丁香园论坛

　　比如上方右侧图片中的这一个个微笑，看着让人难过。如果你经常出现微笑条带，那么最好在制胶的过程中多点耐心，保证凝固均匀大概率就能避免。除了微笑条带外，WB 的翻车情况还有很多，让人防不胜防，有诗为证：

　　凝胶不均匀，条带出微笑

　　抗体有污染，背景有黑斑

　　装置不合适，内部现气泡

　　电极不平衡，结果就倾斜

　　WB 虽基础，细节要注意

　　作为分子生物学、生物化学和免疫遗传学等研究领域较为基础的实验技术之一的 Western Blot（WB）实验，几乎是每个科研人的入门必备。但 WB 实验耗时长、流程繁杂、操作细节多，任何一点风吹草动都可能会导致结果的变形。我们特意整理了 5 个 Tips，帮你走好 WB 实验的每一步：

　　Tip1

　　样品制备——低温快速，裂解充分

　　?全程在低温环境下完成：样品置于冰上，试剂、离心机预冷等。

　　?裂解液的选择：要根据样品类型和下游的定量条件选择合适的裂解液。常用的裂解成分大多包含 Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。

　　?蛋白定量：较常用的是 BCA 法，每次检测样品浓度时，均要绘制标准曲线；当样品浓度太高时，需要进行稀释；加样过程中避免产生气泡，防止气泡引起的误差，保持孔间的均一性。

　　Tip2

　　制胶——胶要均匀，图才好看

　　?要根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶；蛋白分子量越小，需要的分离胶浓度越高；蛋白分子量越大，需要的分离胶浓度越低；

　　? 胶的均匀度直接影响到条带的分离度，胶越均匀，条带越好看；

　　? 灌胶前一定充分混匀且避免气泡产生，玻璃板要干净。

　　Tip3

　　转膜——浸泡活化，保持湿润

　　? PVDF（聚偏二氟乙烯）膜较 NC（硝酸纤维素）膜具有更好的蛋白吸附、物理强度以及化学兼容性，推荐首选 PVDF 膜；

　　? 当目的蛋白分子量 ≤ 20kDa 时，选择 0.22 μm PVDF 膜；当目的蛋白分子量 > 20kDa 时，选择 0.45 μm PVDF 膜；

　　? PVDF 在转膜前先浸泡在甲醇中活化；

　　? 膜在整个实验过程中注意保持湿润，使用镊子夹取，避免手套接触。

　　Tip4

　　封闭——脱脂奶粉最常用

　　? 转膜结束就要进行封闭，封闭液选择原则就是不与抗体或检测试剂有交叉反应。常见的封闭液是脱脂奶粉、BSA、血清。但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用 BSA 封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。

　　Tip5

　　孵育

　　? 抗体稀释时建议参考说明书配比进行稀释，需要先做预实验，找出最佳稀释。

　　在上述实验过程中，电泳环节的制胶尤为重要，直接决定了实验的成败。但是因为过程比较繁琐机械，因此很多的细节往往被大家忽略，导致最终结果出错。诺唯赞推出的重磅新品——新一代蛋白胶预混液试剂盒（Vazyme #E301-E305），就是为了解决大家的制胶难题。从三个方面让你的制胶无忧，点击「阅读原文」即可进一步了解：

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　　2. 方便快捷：上层胶带有颜色，方便点样和区分不同浓度凝胶；

　　3. 无 TEMED：无添加有微腥臭味的 TEMED，使用感极佳。

　　

　　

　　图源：诺唯赞

　　内容策划：康晋伟项目审核：吴军

　　题图来源：站酷海洛