文末有好礼｜酵母表面展示平台快速筛选构象选择性纳米抗体

　　纳米抗体（nanobody，Nb）是在骆驼血清中发现的一种新型抗体，具有相对分子质量小、稳定性高、亲和力高、组织渗透性强以及可识别抗原缝隙表位、进一步改造和表达等特点。Nb筛选技术酵母表面展示是将特定肽或蛋白质基因与酵母自身分泌到细胞外或定位在细胞壁上通常是a-凝集素基因融合,筛选具有特定性质的肽和蛋白质的新方法,是噬菌体表面展示系统和细菌表面展示系统的发展,酵母双杂交系统的补充。

　　纳米抗体的3D结构

　　骆驼科动物单结构域抗体片段(“纳米抗体”)在单个15-kDa免疫球蛋白VHH结构域内提供了抗体的显著特异性。这一独特的特性使其应用范围从用作生化工具到治疗剂。纳米抗体已经成为蛋白质结构生物学中特别有用的工具，促进了对构象动态蛋白质如G蛋白偶联受体(GPCRs)的研究。迄今为止，几乎所有可用的纳米抗体都是通过动物免疫获得的，这是限制该技术许多应用的瓶颈。

　　

　　近期美国研究学者在nature structural &molecular biology发表了一篇名为

　　“Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies”的文章，报道了一个基于酵母表面展示的全体外纳米抗体发现平台，提供了识别纳米抗体的蓝图，通过将纳米抗体与其抗原结晶来展示该文库的效用，最重要的是，我们利用该平台发现了针对两种不同人类GPCRs的构象选择性纳米抗体。

　　一．全合成纳米抗体文库的设计、构建与验证

　　纳米抗体骨架序列来自IGHV1S1–IGHV1S1S5，通过对PDB数据库中已有的93个纳米抗体序列进行比对。设计如下：对CDR1-3个区进行点随机突变组合，有保守位点，有多样性为2，4或者18的随机位点，其中CDR3区又设计了长度的多态性，有三种长度，分别为12，16，20个氨基酸。

　　

　　在所有的纳米抗体的C端融合了一个HA标签，一段长600多个氨基酸的stalk区和酵母细胞壁能进行共价结合，从而使得融合的HA标签-纳米抗体在细胞壁上得以呈现。通过同源重组的方法，将纳米抗体文库插入到酵母表达载体pYDS649中，然后将其转化到酿酒酵母蛋白酶缺陷菌株BJ5465中，最终构建得到库容约为5×10^8的展示库。

　　二、特异性纳米抗体的筛选

　　我们旨在识别靶向人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体，将酵母文库与荧光HSA抗原一起孵育，洗去多余的抗原，并进一步用抗荧光团磁性微珠对所需克隆进行染色。然后通过基于磁体的分离分离标记的细胞，并在标准酵母培养基中扩增(图1e)。

　　图1e纳米抗体选择过程示意图经过四轮选择后(图2a)，分离出单个酵母菌落，用荧光标记的HSA染色，通过分析流式细胞仪进行验证。为了进一步研究，我们选择了一个具有强抗原结合的克隆(命名为Nb.b201)进行深入表征。

　　图2a. 四轮筛选后特异性结合的克隆的比

　　三、构象选择性纳米抗体的筛选（受体：β2AR）

　　Nb.b201在与HSA结合时发生大规模构象变化，导致CDR3主链和氨基酸侧链的重新定向

　　图2c，纳米抗体-HSA复合物(PDB 5VNW)的晶体结构，包括与抗原相互作用的CDR环的特写视图。氢键用虚线表示

　　图2d，c中所示的复合体的旋转视图图2e，比较抗原结合状态(黄色)和无抗原状态(灰色，PDB 5VNV)的纳米抗体结构，显示抗原结合后的构象变化

　　鉴于构象选择性抗体在GPCR研究中的广泛用途，我们使用合成纳米抗体库平台来识别选择性结合β2AR活性构象的纳米抗体(图3)。β2AR在非活性构象（红色）和活性构象（绿色）的集合之间相互转换。受体的活性状态可以通过与受体细胞内表面结合的纳米抗体（黄色）来稳定。采用荧光流式分选法（FACS）筛选表现出与β2AR-激动剂复合体特异性结合的克隆。六轮筛选后特异性结合的克隆占比为23.6%， 最终分离得到13个独特的纳米抗体，且发现抗体CDR3区域高度可变。

　　图3a，β 2AR在非活性构象(红色)和活性构象(绿色)之间相互转换图3a，β 2AR在非活性构象(红色)和活性

　　这些结果不仅揭示了合成纳米抗体-抗原相互作用的机制，还证实了无需使用专门设备或大型动物免疫，在大约两到三周内就可以获得用于晶体学应用的有用纳米抗体。

　　总结：

　　1、建立筛选纳米抗体的体外平台：人工合成纳米抗体文库（NGS测序验证文库质量）酵母表面展示系统进行筛选2 、两步法快速筛选特定纳米抗体：MACS 可大幅减少非特异性克隆，FACS可精准筛选高特异性克隆3、验证合成纳米抗体文库应用的广泛性：3.1 用于筛选特异性抗体：可溶性蛋白 HSA、非纯化蛋白 脂联素GPCRs：β2AR（药理学、晶体学、细胞信号转导验证特异性结合） A2AR（蛋白质体外结合实验验证特异性结合）3.2 检测或稳定蛋白质的特定构象，辅助蛋白质的结构研究（HSA、β2AR、A2AR）

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