来自“草泥马”的纳米抗体
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先“科普”一下啥是“草泥马”，可能年纪大点的老同志还不太知道，是这几年兴起的网络词汇，不过小盆友们应该耳熟能详了，没错，是一群可爱的羊驼……
虽然它没有驼峰，可它还是骆驼科的动物哦。那么啥是纳米抗体呢？这个说来话长，在骆驼和羊驼体内会产生一种独特的抗体：缺失轻链的重链抗体（HcAb）。克隆这种抗体重链可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，也称为纳米抗体（nanobody, a single domain antibody）。纳米抗体具有高亲和力和高特异性的特点，而免疫原性（尽管非人源，但免疫原性很低）和毒性则非常低，且不像scFv那样容易粘连。
纳米抗体最早是由比利时科学家 Hamers 等1993 年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm,长4nm,分子量只有15KD,因此也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb)。它是最小的功能性抗原结合片段。和普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于进行基因改造，体积小，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。
纳米抗体与普通抗体的结构及功能比较
感染或者免疫过的骆驼科动物的免疫反应会产生普通的及仅有重链的抗体，这两种类型的抗体均有与抗原结合的能力。普通的免疫球蛋白的基本结构是分子量为150 k Da的四聚体多肽，由两对相同的重链（50 k Da）和轻链（25k Da）多肽组成，二者由链间的二硫键链接。轻链由N端的可变区（VL）和C端的一个保守的区域(CL)构成。重链由四个或五个结构域组成:N端的可变区（VH），紧接着三至四个恒定的区域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）。免疫球蛋白形成Y型或T型结构，两个抗原结合区域通过CH1及CH2间的柔性铰链区连接在一起，连到负责起效应的具有保守结构的FC区域。在哺乳动物中这种免疫球蛋白的结构相对比较保守。抗体的FC区域由重链的CH2及CH3构成，介导抗体依赖的细胞毒效应（ADCC）及补体依赖的细胞毒效应(CDC)。抗体的N端，配对的VH及VL形成抗体的抗原结合位点（FV）,在轻、重链每个可变区中存在三个氨基酸长度及序列高度变异的区域，简称为CDR1,CDR2,CDR3, 这三个区域被四个序列相对保守的骨架区分隔开（FR1,FR2,FR3,FR4）。轻重链高变区通过非共价结合聚集成簇，形成大的界面与抗原结合，也即为抗体决定簇。这些超变的区域折叠成一些经典的loop结构。重链可变区的CDR3在长度及氨基酸组成上最多变，因此结构也最难预测。重链抗体缺少普通抗体所有的CH1区域，且CDR1和CDR3要比VH长，这在一定程度上弥补了缺失轻链造成的抗原结合力下降的不足。Nanobody的结构简单仅仅是骆驼重链可变区，如下图C：
（Nanobody结构模式图）
A图：传统四链结构的抗体；
B图：骆驼血液中的重链抗体；
C图：稳定的可结合抗原的最小单位VHH也称Nanobody
在序列上，脊椎动物中，普通抗体和纳米抗体序列大部分相同，但存在五个保守位点氨基酸差异。Leu12Ser（即12位在VH中常为Leu, 而在VHH中此位常为Ser）, Val42Phe/Tyr, Gly49Glu, Leu50Arg/Cys, 和Trp52Gly（不是非常保守）。VH中42,49,50,52这四个位点主要参与与VL 作用，多为疏水的氨基酸，但在VHH中变成了亲水的氨基酸，这种序列的改变增加了纳米抗体的水溶性，减少了抗体的聚合性，也直接导致了VHH不能够结合轻链。
在结构上，CDR1由于突变热点的存在（28位和30位），导致VHH向N端延长。VHH的CDR3 也较VH的长，大约为18个氨基酸，而人的VH常为14，鼠11个氨基酸。纳米抗体仅有一个结构域，不含传统的连接肽序列。除了域内保守的二硫键，VHH CDR3中的CYS还可以与CDR1或FR2中的CYS形成二硫键，这些增加的序列和loop结构扩大了抗体与抗原结合的面积以及抗体的多样性，同时导致其结构非常稳定，能够耐受高温及苛刻的极端环境。其次，纳米抗体没有传统的Fc段，从而避免了Fc段引起的补体反应。纳米抗体易于进行基因操作，从而形成单价、双价、双特异及多价抗体，同时也能形成融合蛋白进行靶向治疗。如下图所示。
（不同类型的纳米抗体）
纳米抗体对人体免疫原性较弱，相容性好。 比较VH germline 序列及单峰骆驼germline 序列，前者大约50种，后者大约40种。骆驼的VHH胚系基因序列和人类VH3家族序列高度同源，因此对VHH进行人源化比较简单。
纳米抗体分子量小，结构简单，并由单一的基因编码，因此在噬菌体、细菌及酵母中能大量表达。纳米抗体具有强而快的穿透能力，利于它们进入实体瘤中发挥作用，同时由于其能穿透血脑屏障，为脑部给药提供了新方法。
纳米抗体库的构建
鉴于VHH 与VH的差异主要在于CH1区域的缺失，因此，建免疫和天然库的工作重点在于从IgG中分离出缺少CH1的抗体。可以通过一步或者二步PCR扩增来实现。PCR的关键在于利用抗体骨架区的保守核苷酸序列来设计PCR引物。对于一步法PCR,可以扩增从FR1到铰链区序列，同时在引物上引入酶切位点。对于两步法PCR，第一步PCR: Leader sequence to CH2的保守区。会产生两种产物，VH（大约 850-900bp）及 VHH （大约550-600bp）。从PCR产物中分离出VHH。第二步 PCR: 以第一步PCR产物为模板，应用可变区的FR1到FR4的保守区设计引物，扩增出VHH序列，同时也引入酶切位点方便下一步实验。扩增出的抗体序列连接到载体上，其余的步骤同普通的构建抗体库的过程。具体流程见下图。一般纳米抗体库容量可以比较容易达到10e8或10e9，多样性大于95%。同时由于VHH只有一个可变区，库容在10e6时也能筛选到特异性抗体。但是在普通的抗体Fab 或者ScFv库中，需要库容足够大才能更容易地筛选得到抗体。
（纳米抗体库的构建及纳米抗体的淘选）
VHH可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。
纳米抗体的淘选
纳米抗体的淘选和普通抗体的淘选比较类似，可以通过噬菌体展示的方法，淘选到抗原特异性抗体。将普通抗原固定在固相支持的载体上，经过封闭，结合，洗脱，扩增等阶段富集抗原特异性抗体。一般通过2-3轮淘选即可筛选到特异性抗体。同时也可以在液相中淘选，利用SA包被的磁珠与生物素标记的抗原间的特异性结合，也经过封闭，结合，洗脱，扩增等步骤得到抗原特异性抗体。除了普通的蛋白淘选，也可以用表达特异性抗原的细胞进行淘选，大体步骤也同蛋白淘选。为了提高淘选得到蛋白的亲和力，在每轮淘选时可以连续降低抗原的浓度或者细胞的量，同时逐步增加洗涤的次数。在封闭时加入一些阴性对照蛋白或者细胞能提高淘选到的抗体的特异性。淘选得到的抗体依载体的不同，可以表达在上清或者细胞周质里，通过ELISA或者FACS验证抗体与抗原的结合能力。为了下游动物实验的进行，需要筛选到人、鼠、猴三阳的抗体。
纳米抗体的优势
纳米抗体诸多方面均优于传统抗体 。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。相比于常规抗体，纳米抗体的优势有:
1.分子量小，可穿透血脑屏障；
2.原核或真核系统中高表达；
3.特异性强，亲和力高；
4.对人的免疫原性弱；
5.稳定性好；
6.可溶性高，吸收好；
7.人源化简单；
8.偶联其他分子容易。
纳米抗体的应用
纳米抗体能用于：
生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发)；
临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)；
肿瘤研究、免疫学研究等基础研究；
申请具有自主知识产权的发明专利及科研奖项；
拓展研究思路、发表国际知名学术刊物。
举例：
1.纳米抗体能用于构建多重不同类型的分子结构，在医学诊断和治疗上实用性较高。例如可以构建成双功能抗体或双特异性抗体进行疾病的靶向治疗。双特异性抗体可以识别一个靶抗原的相邻两个位点，获得对抗原的高亲和性，也可以识别不同的抗原，如肿瘤细胞和免疫细胞表面的抗原，达到治愈疾病的目的。与普通的双特异性抗体相比，它们分子量小，水溶性及稳定性高，表达量也普遍较高。
2.通过基因改造，纳米抗体可以形成多聚体，大大提高了抗体与抗原的结合能力。通过基因工程形成纳米抗体融合蛋白可以带上酶或者毒素，融合蛋白在组织穿透，清除速度及稳定性上比普通抗体更有优势，可以用于低浓度抗原的检测。
3.由于纳米抗体结构稳定，也可应用于蛋白晶体结构研究中。纳米抗体形成的蛋白复合物能稳定抗原，保持其晶体结构，是研究不稳定的蛋白良好载体。
4.纳米抗体也能作为胞内抗体发挥作用。大部分抗体在细胞内没有功能，因为在细胞质还原环境中不能形成二硫化合物，或者靶向亚细胞部位比较困难，但纳米抗体通常比较稳定，甚至在胞质中能维持其抗原结合能力。
纳米抗体发展到现在，已经拥有广泛的应用价值，由于分子量小，结构稳定，容易进行基因改造，生产成本低，易于进行大规模生产，因此，纳米抗体在疾病治疗和诊断及肿瘤的靶向诊断和治疗中具有很大的发展机遇。现在专门有个公司叫Ablynx (http://www.ablynx.com/)专门从事这种单纳米抗体相关产品的研究与开发。目前已经有两种抗体类药物处于二期临床。
