深度盘点：一文带你读懂CADD如何在抗体药物发现中发挥作用

　　

　　

　　在当今中国创新药研发遍地开花的时代，治疗性抗体药物由于其具备高特异性、低毒副作用等优势，已成为各大药企和Biotech公司争相占据的高地。然而，要想将一款抗体药成功从研发到商业化，必然需要经历漫长的周期。若能在初期的药物发现阶段即找到结构创新、性能优异且成药性极佳的苗头抗体，这将大大加速抗体药商业化的进程。传统的抗体发现技术（如杂交瘤筛选、噬菌体展示等）不仅花费高、耗时长，对于一些难成药靶点，传统的方法很难筛选得到合适的抗体，越来越多的科学家都在尝试采用智能计算来弥补传统方法的局限性[1]。今天Dr.X选取智能计算的分支之一——计算机辅助药物设计（CADD），为大家介绍它在抗体药物发现中的四大重点应用场景。

　　● 从序列到结构

　　● 抗原表位预测

　　● 亲和力成熟

　　● 从头设计

　　

　　从序列到结构

　　AlphaFold2可以根据氨基酸序列预测出几乎世界上所有蛋白质的结构，但是它在预测抗体结构时仍然存在局限性。这是由于抗体的结构更加复杂多变，特别是互补决定区域（CDRs），作为最容易与抗原结合的区域，预测该结构的准确性直接影响了所得抗体的特异性。目前最常见的蛋白结构建模方法是同源建模（homology modeling），其原理是将蛋白序列和人类已知结构的蛋白序列进行比较，相关的蛋白或者蛋白域被当作结构模板，填补目标序列中对应的区域。Jinwoo Leem等[2]提出AbodyBuilder模型对纳米抗体片段进行结构预测，可以达到亚埃级别的预测精准度。模拟过程包括模板选择、构象预测、CDR环状结构模拟以及侧链预测四个步骤，并且该模型通过对抗体的CDR区域各单元的偏差范围来评估该模型的置信度。从比对结果看，AbodyBuilder建立的模型能够在~30s内即可计算得到与其他方法接近的预测效果，具有非常广阔的应用前景。

　　

　　图1 利用计算模型设计得到的CDR环形结构各区域的均方偏差分布比较[2]

　　

　　抗原表位预测

　　常见的抗原表位预测的实验方法有蛋白质“切割”法、表位肽扫描技术、核磁共振、冷冻电镜解析晶体结构等等，对于计算化学来说，通常采用全局分子对接（Global docking）的方式进行，它主要包含两部分：取样（sampling）和打分（scoring）。首先基于Mote Carlo或快速傅里叶变换等模型进行的取样计算，生成不同的蛋白结构，然后通过打分函数进行筛选过滤，得到符合理论模型的候选分子。Monte Carlo是一种随机取样的方法，通过跳跃式的构象选择方式可以避开局部势能最低。图2即为Monte Carlo取样方法的原理示意图：根据能量的变化可对取样结果进行判定，绿色箭头代表可接受的取样方式，红色箭头代表被拒绝的取样方式。通常用于该模拟的动作包括蛋白片段的替代以及侧链旋转异构体的替换[3]。Monte Carlo取样方法的优点是对低能构象的取样几率更大。此外，打分函数的合理性也关系到抗原表位预测的准确度，根据不同的评价体系可分为基于力场、基于理论知识和基于经验发展而来的打分函数等。科研人员需要根据不同的应用场景，选择合适的打分函数进行候选分子的筛选。

　　

　　图2 Monte Carlo取样方法原理示意图[3]

　　

　　亲和力成熟

　　对于生物药研发来说，亲和力是判断药效的关键参数之一，通过测定抗体和抗原的解离平衡常数（KD）即可判断二者的亲和力大小。那么问题来了，为什么CADD可以用于亲和力成熟？这是因为结合自由能的变化与配体-受体复合物的解离常数的对数呈线性关系，当计算结合自由能的时候，便可预测配体和受体之间的亲和力。对于药物研发人员来说，亲和力成熟是抗体药物发现阶段中必不可少的环节，然而传统的亲和力成熟方法存在库容小、耗时长、随机性大、成功率低等缺点。为了尽可能减少突变的随机性，提升亲和力成熟的目的性，Bardera等[4]在利用实验手段确认胃泌素17抗原表位的前提下，采用“CDR3区域随机突变与抗体理性设计结合”的方式，在原本TA4 scFv抗体的基础之上，借助docking手段将抗体结合到期望的活性位点，然后通过计算机模拟预测亲和力，筛选得到较优的突变残基，再基于模拟结果构建对应的噬菌体展示体系，最终将抗体亲和力提升至原来的454倍。由此可见，CADD有助于人们实现基于结构的理性设计，并且通过计算和实验的融合可以加速抗体亲和力成熟阶段，提升抗体的药用潜力。

　　

　　图3 CDR-H3和CDR-L3随机突变和定向亲和力成熟库筛选得到的抗胃泌素17克隆序列[4]

　　

　　从头设计

　　当传统实验手段无法得到抗体的时候，比如针对离子通道等膜蛋白靶点，人们会考虑采用抗体的从头设计（de novo design），即基于某一序列生成对应的三维结构。一般而言，从头设计的方法并不是凭空设计，通常还需要对一些已知残基构象或者蛋白碎片进行采样，并且基于某些包含以往实践经验的数据库（例如PDB）进行结构生成，然后再对某些氨基酸残基进行突变，由此获得大量的候选抗体，最后再利用打分函数选择最有潜力的抗体结构。Baran等[5]结合Rosetta平台和实验手段，经过5轮结构设计和实验验证，开发出一套基于自然抗体的骨架结构和保守序列信息的算法，可以设计出与天然抗体序列不同，但亲和性和稳定性几乎相近的抗体序列。实验结果表明，计算得到的分子结构与实验筛选的结果一致性很高，验证了该算法的可行性。通过对自然语言的学习以及合理的抗体结构设计，CADD能够实现基于符合药用前景的抗体从头设计。

　　

　　图4 经过5轮结构设计和实验验证循环增强了抗体的表达效率[5]

　　

　　综上所述，CADD在抗体药物发现中的应用已得到了实验验证，实际上CADD在抗体药物的临床应用端也能够发挥极大的作用。cetuximab作为临床首款获批的靶向EGFR的单抗，由于其表位易于产生获得性点突变，引起结直肠癌患者耐药，因此其临床应用有所限制。为了有效解决获得性耐药的问题，Zhuang 等[6]提出“结构引导+噬菌体辅助的设计方法（SGAPAE方法）”，基于Rosetta平台模拟抗体与靶点结合前后的能量变化，开发出半理性设计的cetuximab突变库，保留特定残基的前提下进行随机突变，筛选获得三种cetuximab突变体，不仅在CDR区域沿袭了cetuximab本身较优的理化性质来保证可开发性，同时大幅度提升cetuximab耐药性，解决了临床用药的问题。

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　　参考文献

　　[1] Pedrioli et al, Trends in Immunology, December 2021, Vol. 42, No. 12

　　[2] J. LEEM et al, MABS, 2016, VOL. 8, NO. 7, 1259–1268

　　[3] Brian et al, Nature Review | Molecular cell biology November 2019, Vol. 20, 681-697

　　[4] Barderas et al, PNAS, July 1, 2008, vol. 105, No. 26, 9029-9034

　　[5] Baran et al, PNAS, October 10, 2017, vol. 114, No. 41, 10900-10905

　　[6] Zhuang et al, Nature Communications | (2022) 13:4431

　　

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