miR-181抑制剂及其用途的制作方法

　　mir?181抑制剂及其用途技术领域1.本发明涉及能抑制mir?181的药物，其用于治疗和/或预防线粒体疾病，包括累及眼和/或脑(eye and/or brain involvement)的线粒体病以及与线粒体功能障碍有关的影响眼和/或脑的神经退变性病况。背景技术：2.线粒体是不同细胞过程中的关键角色，其功能障碍直接或间接导致各种人类疾病的发病，例如直接导致线粒体疾病(md)发病或间接导致常见神经退行性疾病(包括帕金森氏病(pd)或阿尔茨海默氏病(ad))发病，其中线粒体功能障碍被描述为发病机理中的主要因果要素(参考：pmid：23567191)。3.原发性线粒体疾病(pmd)是一组异质性疾病，由涉及氧化磷酸化(oxphos)的线粒体或核编码基因突变引起。pmd的临床表现范围从单个组织/器官病变到多器官综合征，显著累及中枢神经系统(cns)，其对线粒体功能障碍特别敏感。pmd包括：leigh综合征，leber遗传性视神经病变(lhon)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(melas)，kjer视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(narp)，常染色体显性视神经萎缩，kearns?sayre综合征，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(merrf)综合征。继发性线粒体疾病(smd)是由直接影响线粒体功能的核基因突变引起的一组疾病，包括friedreich共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症。4.尽管每种疾病都很罕见，但总体上，成年md的总患病率估计为4300分之一左右，代表了遗传性神经疾病中最普遍的群体之一(gorman等，2015)。5.影响中枢神经系统和/或眼部的神经退行性疾病通常与线粒体功能障碍有关；所述疾病可能是散发性或家族性的：例如，与年龄相关的散发性神经退行性疾病包括帕金森氏病(pd)，阿尔茨海默氏病(ad)，年龄相关性黄斑变性(amd)，糖尿病性视网膜病变，青光眼。6.家族性神经退行性疾病包括家族性pd，ad，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(rp)，斯塔加特氏病。7.线粒体疾病(pmd和smd)在生化和遗传上都是异质的，到目前为止，其复杂性阻止了有效治疗方法的开发。对于大多数患者，治疗仅限于预防或治疗并发症，例如糖尿病，心脏损害和癫痫。可用的治疗是支持性的(不能解决主要缺陷)或针对线粒体功能障碍的特定方面。因此，迄今为止尚无有效的疗法，治疗已确立的线粒体疾病患者仍然存在极大挑战(lightowlers等，2015；viscomi等，2015)。最近，已测试了线粒体生物发生/动力学或线粒体清除/质量控制的特异性调节作为体外和体内md模型的可能治疗策略(cerutti等,2014；civiletto等,2018；civiletto等,2015；johnson等,2013；viscomi等,2011)。尽管有一些令人鼓舞的数据，但随后的方法产生了不一致的结果，并且在不同的md模型中均无效[(lightowlers等,2015；viscomi等,2015)综述]。因此，需要更有效地调节线粒体途径作为md的治疗策略。[0008]对于神经退行性疾病，例如pd或ad，尚未有有效疗法。ad是痴呆的最常见原因，占病例的60?80％，而工业化国家pd的患病率据估计在60岁以上人群中为1％，这是迄今为止卫生系统的重要负担，因为迄今的治疗选择大部分是针对疾病症状的(barnes&yaffe，2011；de lau&breteler，2006)。[0009]微小rna(mirna)是基因表达的基础精细调节剂，由于具有同时调节参与疾病发病机理和进展的多种分子途径的能力，代表了具有前景的治疗工具。mirna的调节已出于治疗目的应用于不同疾病，并已在特定情况下达到临床前和临床阶段(broderick&zamore，2011；christopher等，2016；janssen等，2013；ling等，2013)。mirna在神经元存活中起着关键作用，而且越来越多的证据表明mirna调控的基因网络的改变会增加神经退行性疾病的风险(hebert&de strooper，2009)。mir?181家族成员由位于三条独立染色体上的三个独立的初级转录本产生。每个转录本产生两条前体序列，总共六条前体序列。每个前体产生两条mirna链：引导链或5p，以及信使链或3p，共十种成熟mirna形式：mir?181a?5p,mir?181a?1?3p,mir?181a?2?3p,mir?181b?5p,mir?181b?1?3p,mir?181b?2?3p mir?181c?5p,mir?181c?3p,mir?181d?5p和mir?181d?3p。5p成熟序列在哺乳动物组织中显示最大丰度表达水平(karali等,2016)；且包含相同的5’“种子”序列，提示了显著程度的功能性冗余(henao?mejia等,2013；ji等,2009)。如本文所用，六种成熟5p mirna定义为：mir?181a?1,mir?181a?2,mir?181b?1,mir?181b?2,mir?181c,和mir?181d。mir?181a?1和mir?181a?2的成熟形式，以及mir?181b?1和mir?181b?2在序列上是相同的；mir?181c成熟形式与mir?181a相比有一个核苷酸的不同，而mir?181d成熟形式与mir?181b有一个核苷酸的不同。mir?181a和mir?181b(mir?181a/b)在脊椎动物中是高度保守的，且在大脑和视网膜的不同区域中高度表达(boudreau等,2014；karali等,2016)，且近来被报道靶向涉及线粒体依赖性细胞死亡(hutchison等,2013；ouyang等,2012；rodriguez?blazquez等,2015)和自噬(cheng等,2016；he等,2013；tekirdag等,2013)的基因。技术实现要素：[0010]本发明涉及mir?181抑制剂，其用于治疗和/或预防线粒体疾病，包括累及眼和/或大脑的线粒体病以及与线粒体功能障碍有关的影响眼和/或大脑的神经退变。[0011]本发明人出乎意料地发现mir?181，特别是mir181a和b参与线粒体功能的整体调控，这种调控是通过控制与cns中抗氧化反应、线粒体生物发生和功能化相关的基因；此外，本发明人还发现mir?181a/b调控线粒体依赖性程序化细胞死亡和自噬/线粒体自噬相关基因的表达，同时精细调节cns中的线粒体途径。[0012]发明人出乎意料地证明，mir?181的抑制在md和与线粒体功能障碍相关的神经退变中发挥神经保护作用，对于遗传异质性的疾病如md，pd和rp尤其高度相关，对此非基因依赖性的治疗策略非常可取。[0013]本发明人发现，mir?181a/b通过生物发生和清除的精细协调来调节线粒体转换。发明人还发现，抑制mir?181可对以线粒体功能障碍为特征的几种病理学产生有益的影响，特别是通过保护其免受疾病中的线粒体介导的细胞死亡和神经退变等的侵害，所述疾病例如pmd，包括leigh综合征，leber遗传性视神经病变(lhon)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(melas)，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(merrf)，进行性眼外肌麻痹(peo)，皮尔逊氏综合征，母体遗传性肌病和心肌病(mimyca)，凯氏视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(narp)，常染色体显性视神经萎缩，kearns?sayre综合征，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(merrf)综合征；smd，包括friedreich氏共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症(charcot?marie?tooth disease)；与线粒体功能障碍有关的影响中枢神经系统和/或眼的神经退行性疾病：包括散发的与年龄相关的神经退行性疾病，例如帕金森氏病(pd)，阿尔茨海默氏病(ad)，年龄相关性黄斑变性(amd)，糖尿病性视网膜病变，青光眼；家族性神经退行性疾病，包括家族性pd，ad，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(rp)，斯塔加特氏病。[0014]然后，本发明提供了用于治疗和/或预防线粒体疾病的mir?181抑制剂。[0015]在本发明中，线粒体失调和线粒体疾病被同等地使用。[0016]根据本发明的该方面，线粒体疾病的治疗和/或预防可以有效减轻所述疾病的至少一种症状。[0017]据认为，当治疗疾病的潜在原因时，同样可以实现症状的管理。通过症状的管理，意在可以保持症状的严重程度(即，控制症状的恶化或发展)，或更优选地，可以全部或部分地减轻症状的严重性。[0018]本文中所用的“治疗”(及其语法变化形式)或“预防”(及其语法变化形式例如“预防”或“预防”)指试图改变受治疗的个体的自然病程，并且可供预防或在临床病理学的病程中采用的临床介入。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病或病症的发生或复发、缓减症状、减少疾病或病症的任何直接或间接病理学结果、防止复发、降低疾病或病症进展速度、缓解或缓和疾病或病症状态和减轻或改善预后。在一些实施方式中，本发明的抑制剂用于延缓疾病或病症发展或减缓疾病或病症进展。[0019]优选所述抑制剂是抑制性核酸药剂，小分子或基因组编辑剂。编辑剂是可以介导目标基因破坏或修复的试剂，其中所述试剂是工程化核酸酶，例如锌指核酸酶，转录活化物样效应核酸酶或成簇规则间隔短回文重复系统。[0020]优选地，抑制性核酸剂选自：本文定义的sirna，反义寡核苷酸(例如，安塔够妙(antagomir)，lna)，mirna海绵和/或核酶。[0021]还优选mir?181的抑制剂包含与mir?181互补的至少一种序列。优选地，mir?181的抑制剂包含至少一条与acauuca互补的序列(seq id no.5)或包含acauuca(seq id no.5)。优选地，所述抑制剂降低mir?181的功能和/或活性。[0022]mir?181的功能和活性可以通过本领域中任何已知的方法来测量，特别是如本文所述的方法。[0023]更优选地，所述抑制剂具有选自以下的至少一种性质：抑制mirna活性，优选抑制mrna靶标结合，增加至少一种特定mir?181靶标的mrna水平，改善线粒体功能，增加线粒体数量，减少氧化应激和/或细胞死亡，改善细胞存活率。[0024]上述性质可以通过本领域中任何已知的方法来测量，特别是如本文所述的方法。[0025]优选地，所述mir?181是mir?181前体或成熟的mir?181，优选所述mir?181选自mir?181a?1，mir?181a?2，mir?181b?1，mir?181b?2，mir?181c和mir?181d或其组合。[0026]优选地，mir?的抑制剂包含序列acauuca(seq id no：5)或包含序列acauuca(seq id no.5)并且与seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3或seq id no.4具有至少80％的序列同一性。优选地，它与seq id no.1或seq id no.2或seq id no.3或seq id no.4具有至少85％，90％，95％，99％的同一性。[0027]仍优选地，所述抑制剂长18至21个核苷酸。[0028]在一个优选的实施方案中，所述mir抑制剂是具有下式的mirna海绵：[0029](x1sx2sx3)n1s2(x1sx2sx3)n2[0030]其中，[0031]x1,x2和x3独立选自：[0032]?与mir?181a和/或mir?181c互补的mps seq，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；[0033]?与mir?181b和/或mir?181d互补的mps seq，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；[0034]x3可以存在或不存在；[0035]s是4?6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；[0036]s2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为xbai限制性内切酶的位点。[0037]n1和n2是独立选自3、6和24的数字，优选地在3、6和12之间，最优选地n是3，n1和n2可以相同或不同。[0038]在一个优选的实施方案中，所述mirna海绵具有下式：[0039](asb)n1s2(asb)n2[0040]其中：[0041]a是与mir?181a和/或mir?181c互补的mps seq，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起；[0042]b是与mir?181b和/或mir?181d互补的mps seq，优选从核苷酸9到核苷酸12经修饰以产生凸起(bulge)；[0043]s是4?6个核苷酸的间隔子序列，优选为4个核苷酸；[0044]s2是4至6个核苷酸的中央间隔子序列，优选为6个核苷酸，优选对应于限制性内切酶位点，优选为xbai限制性内切酶的位点。[0045]n1和n2是独立选自3、6和24的数字，优选地在3、6和12之间，最优选地n是3，n1和n2可以相同或不同。[0046]优选x1,x2,x3,a是3’ttgtaagtn1n2n3n2acagccactca 5’(seq id no.113)其中根据iupac命名学[0047]n1＝a或c或g[0048]n2＝a或c或t[0049]n3＝a或gc或t[0050]或其中x1,x2,x3,b是3’ttgtaagtn’1n’1n’2n’3acagccaccca 5’(seq id no.114)[0051]其中根据iupac命名学[0052]n’1＝c或g或t[0053]n’2＝a或g或t[0054]n’3＝a或c或t[0055]或其中n1＝3且n2＝3；[0056]或其中s由4个核苷酸组成，优选s＝tagc；[0057]或其中s2由6个核苷酸组成，优选s2＝tctaga。[0058]优选地，抑制剂的序列还包含一个或多个锁核酸(lna)核苷酸和一个或多个非锁核苷酸，其中至少一个非锁核苷酸包含化学修饰，优选锁核酸(lna)核苷酸具有2'至4'亚甲基桥，优选化学修饰为2'o?烷基或2'卤素修饰。[0059]仍然优选的是所述mir?181抑制剂与至少一种其他试剂一起使用。[0060]更优选地，所述至少一种另外的试剂是如上以及在本发明中定义的mir?181的抑制剂。[0061]然后，该用途是指一种或多种mir?181抑制剂，即一种或多种sirna，反义寡核苷酸(例如，安塔够妙(antagomir)，lna)，mirna海绵和/或核酶的组合，它们可以相同或不同。[0062]在一个优选的实施方案中，所述至少一种其他试剂选自改善线粒体功能的试剂，选自：增强线粒体生物发生的试剂(即激活控制线粒体生物发生的通路，从而导致氧化磷酸化增强和/或改善呼吸链复合物的缺陷活性的药物，例如nad+前体(例如，烟酰胺核糖苷等))，ampk激动剂(例如aicar)，聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂(例如奥拉帕尼(olaparib，azd?2281)等)，白藜芦醇，二甲双胍，视黄酸，调节自噬的药物，例如自噬激活剂，例如mtor抑制剂(如雷帕霉素)，一种抑制细胞凋亡的药物，ros清除剂，例如抗氧化化合物，包括硫辛酸，维生素c和e，以及coq，一种改变异质性的药物，一种有毒化合物的清除剂，n?乙酰半胱氨酸(nac)，甲硝唑，核苷酸补剂，通透性转换孔抑制剂(例如环孢菌素a或其衍生物)，替代丢失的因子的药物，例如酶替代疗法，其中体内缺陷或缺失的酶被替代，或者基因疗法，例如将核酸作为治疗疾病的药物治疗性地输送到患者的细胞中。[0063]本发明优选的其它药剂是用于治疗本发明的疾病的药剂，例如用于治疗lhon疾病的药剂：艾地苯醌是泛醌的合成类似物，其作用是改善大脑中的线粒体氧化代谢并减少氧化应激(lyseng?williamson，2016；sanchez等，2016)。羟钴胺素(维生素b12的合成的可注射形式)，包含人类野生型线粒体nd4基因的重组aav血清型2，包含人类野生型线粒体nd1基因的重组aav载体，阿来普肽(线粒体膜通透性转换孔开放阻断剂)。[0064]优选地，所述mir?181的抑制剂和所述至少一种其他试剂是依次或同时施用的。[0065]本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗和/或预防线粒体疾病的如前述实施方案中任一项所定义的mir?181抑制剂，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。[0066]优选地，所述组合物还包含至少一种另外的试剂，优选所述至少一种另外的试剂是如上定义的mir?181的抑制剂，优选所述至少一种另外的试剂选自：增加线粒体生物发生的试剂，调节自噬的试剂，抑制细胞凋亡的试剂，ros清除剂，改变异质性的试剂，有毒化合物的清除剂，核苷酸补剂，替代缺失基因的试剂。[0067]本发明进一步提供一种在有需要的对象中治疗线粒体疾病的方法，其包括向该对象施用至少如上定义的mir?181抑制剂或如上定义的药物组合物。[0068]本发明还提供了包含至少一种如上定义的mir?181抑制剂和启动子序列的载体，优选该载体是病毒载体，并且优选地是腺相关病毒载体，其用于治疗和/或预防线粒体疾病。[0069]优选地，线粒体疾病是原发性或继发性线粒体疾病。[0070]优选地，线粒体疾病选自：累及眼和/或脑的线粒体疾病，影响眼和/或脑的神经退变，所述神经退变与线粒体功能障碍有关。[0071]还优选地，线粒体疾病选自：leigh综合征，leber遗传性视神经病变(lhon)，线粒体肌病，脑病，乳酸性酸中毒和中风综合征(melas)，肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(merrf)，进行性眼外肌麻痹(peo)，皮尔逊氏综合征，母体遗传性肌病和心肌病(mimyca)，凯氏视神经病变，共济失调性神经病变和色素性视网膜炎(narp)，常染色体显性视神经萎缩，kearns?sayre综合征，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(merrf)综合征，friedreich氏共济失调，遗传性痉挛性截瘫，腓骨肌萎缩症，散发的与年龄相关的神经退行性疾病，帕金森氏病(pd)，阿尔茨海默氏病(ad)，年龄相关性黄斑变性(amd)，糖尿病性视网膜病变，青光眼，家族性神经退行性疾病，家族性pd，ad，亨廷顿氏病，色素性视网膜炎(rp)，斯塔加特氏病。[0072]通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。[0073]附图简要说明[0074]图1.mir?181a/b调节线粒体的生物发生和线粒体自噬。[0075]a)qrt?pcr证实mir?181a/b沉默导致sh?sy5y细胞中mir?181a/b预测靶标的上调。n＝3次独立实验。[0076]b)mir?181?模拟转染特异性抑制含有wt 3'?utr预测靶序列的构建体的萤光素酶活性。mir?181a/b结合位点的点突变(mut)消除了萤光素酶抑制作用。数据对阴性模拟转染标准化(虚线)。n＝6次独立实验。[0077]c)qrt?pcr显示mir?181a/b?1?/?对mir?181a/b?1+/+动物眼中mir?181a/b靶标的上调。n≥5只动物/基因型。[0078]d)mir?181a/b?1?/?小鼠相对于mir?181a/b?1+/+小鼠表现出增加的mtdna含量。n＝4动物/基因型。[0079]e)wb分析(左图)显示mir?181a/b?1?/?(?/?)小鼠与mir?181a/b?1+/+(+/+)小鼠相比，线粒体蛋白水平升高(右图量化)。数据对p115或gapdh标准化。n＝3动物/基因型。请注意，来自+/+和?/?样品的所有比较条带均来自相同的印迹，为清晰显示数据，这些印迹已裁剪并分开显示。[0080]f)线粒体和胞质部分的wb分析(左图)显示?/?与+/+小鼠眼的线粒体部分中p62和parkin水平升高(右图量化)。分别将线粒体和胞质组分的数据对ndufb8或gapdh标准化。n＝3动物/基因型。[0081]*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001单尾(在a?c和e中)和双尾斯氏t检验(在d中)。[0082]图2.mir?181a/b抑制作用抵消具有线性皮肤缺损(mls)的小眼畸形青鳉鱼(medakafish)模型中的细胞死亡。[0083]a)在st30青鳉鱼对照和mo注射的胚胎的视网膜和脑切片上进行的tunel分析显示注射hccs?mo/mir?181a/b?mo?和cox7b?mo/mir?181a/?mo的胚胎中凋亡细胞的数量与分别注射hccs?mo?和cox7b?mo?的胚胎相比有所减少。比例尺为20μm。[0084]b)tunel阳性细胞/眼。每个模型n≥5个视网膜。[0085]c)胱冬酶实验显示注射hccs?mo/mir?181a/b?mo?和cox7b?mo/mir?181a/?mo的胚胎中与分别注射hccs?mo?和cox7b?mo?的胚胎相比胱冬酶?3和胱冬酶?9活性水平有所恢复。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。负二项式广义线性模型的偏差分析(b中)；具有事后tukey分析的单向方差分析(c中)；误差线是sem。[0086]图3.mir?181a/b下调改善了mls青鳉鱼模型的表型。[0087](a?i)单独注射hccs?mo(b)和cox7b?mo(h)或与mir?181a/b?mo共同注射(c，i)的st30青鳉鱼胚胎的代表性图像。共注射mir?181a/b?mo可在hccs?mo和cox7b?mo胚胎中拯救小眼畸形和小头畸形。[0088](d?f，j?l)用baf?a1，pd98059或ha14?1处理注射了hccs?mo/mir?181a/b?mo?和cox7b?mo/mir?181a/b?mo的胚胎。baf?a1处理抵消了hccs?mo/mir?181a/b?mo和cox7b?mo/mir?181a/b?mo胚胎中mir?181a/b下调的保护作用(d，j)。pd98059处理不会干扰mir?181a/b下调介导的mls表型的调节(e，k)。ha14?1处理抵消了hccs?mo/mir?181a/b?mo模型中mir?181a/b下调的作用，但不影响cox7b?mo/mir?181a/b?mo胚胎(f，l)。比例尺为100μm。[0089](m?n)hccs?mo(m)和cox7b?mo(n)胚胎中在(a?l)中所示的不同条件下有或没有mls表型的胚胎的百分比。n≥300个胚胎/条件，**p<0.01；***p<0.001，广义线性模型的偏差分析；误差线是sem。[0090]图4.在鱼藤酮诱导的lhon综合征小鼠模型中，mir?181a/b?1的失活可保护rgc免受细胞死亡。[0091]a)玻璃体内注射鱼藤酮或dmso的mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠视网膜中用抗neun抗体进行免疫荧光分析。与对照组相比，在注射鱼藤酮的mir?181a/b?1?/?小鼠中，rgc在注射后1周和2周时均被保留。比例尺为50μm。[0092]b)注射后一和两周的rgc数量/mm(以％表示)n＝10。[0093]c)视动跟踪实验结果的图形表示，报道为周/度的倍数变化。与对照组相比，在注射鱼藤酮的mir?181a/b?1?/?小鼠中，与对照相比视敏度在注射后1周和2周时均被保留。n＝10。[0094]***p<0.001，具有事后tukey分析的单向方差分析(b，c中)；误差线是sem。[0095]d)玻璃体内注射鱼藤酮或dmso的mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠视网膜切片中的nadh脱氢酶组化反应。注射后1周，mir?181a/b?1+/+鱼藤酮注射的眼睛的rgc(gcl，虚线内的区域)中nadh脱氢酶活性消失，而在mir?181a/b?1?/?鱼藤酮注射的眼睛中其被保留。gcl，神经节细胞层onl；inl，内核层；外核层。比例尺为50μm。[0096]e)在注射了鱼藤酮或dmso的mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠的视网膜中用抗coxiv抗体进行免疫荧光分析，结果显示在mir?181a/b?1?/?注射鱼藤酮的眼睛里线粒体保留。比例尺为10μm。[0097]图5.mir?181a/b耗竭保护ndufs4?/?小鼠的rgc并改善其视觉功能。[0098]a?d)在wt，ndufs4?/?，ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?和mir?181a/b?1?/?小鼠的视网膜中用抗neun抗体进行免疫荧光分析。相对于ndufs4?/?小鼠，在ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?中rgc被保留。比例尺为50μm。e)rcg数/mm(％)，n＝5。f)视动跟踪实验结果的图形表示，报道为周/度的倍数变化。相对于ndufs4?/?小鼠，在ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?中视敏度被保留。n≥8。g,h)视网膜电图分析揭示，相对于ndufs4?/?小鼠，在ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?中b波型有所改善。n≥5。[0099]p值在e?f中通过事后tukey分析进行单向anova计算，并在g中通过事后分析进行两次anova重复测量。g中的p值表示20log cd.s/m2和明视(photopic)点。其他点的p值在附录表s1中报告；误差线是sem。[0100]图6.mir?181a/b耗竭增加了nrf1和park2转录本水平，并增强了ndufs4?/?视网膜的线粒体自噬。[0101]a)q?rt?pcr揭示在ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?动物的眼内，相对于ndufs4?/?动物mir?181a/b靶标nrf1和park2上调。n＝4只动物/基因型。b)细胞死亡分析显示，在用fccp处理的sh?sy5y细胞中，nrf1下调消除了mir?181a/b介导的保护作用。n＝4。c)线粒体部分的wb分析显示，与ndufs4?/?小鼠相比，获自ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?的眼的线粒体部分中的p62和parkin(在d中量化)水平提高。数据对于cs标准化。n＝3只动物/基因型。在b中通过事后分析的单因素方差，在d中进行单尾斯氏t检验来计算p值。误差线是sem。[0102]图7.mir?181a/b耗竭可增强ndufs4?/?小鼠的线粒体生物发生。[0103]a?c)电子显微镜分析显示ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?小鼠相对于ndufs4?/?小鼠线粒体形态的改善和线粒体数目的增加。比例尺为1μm。线粒体的定量增加在c中以p30和p55的线粒体/rgc数表示。n≥2只动物/基因型。d)通过q?pcr测定，ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?小鼠相对于ndufs4?/?小鼠表现出增加的mtdna含量。n≥4只动物/基因型。e)ndufs4?/?/mir?181a/b?1?/?相对于ndufs4?/?小鼠中，以柠檬酸合酶(cs)活性的百分比标准化的mrc复合物i，ii和iv的生化活性。n≥3只动物/基因型。p值是通过双尾斯氏t检验计算得出的；误差线是sem。[0104]图8.mir?181a/b抑制作用保护da神经元对抗6?ohda诱导的青鳉鱼中的细胞死亡。[0105]a)青鳉鱼脑中的rna ish显示，在蓝斑核(locus coeruleus)中的da神经元中显示mir?181a和mir?181b的强表达(箭头)。比例尺为100μm。[0106](b?d)在st38对照(dmso处理)(b)，6?ohda处理的对照(c)和6?ohda处理的mir?181a/b?mo注射的(d)青鳉鱼脑上进行抗th免疫组织化学染色以显示da神经元。6?ohda处理可导致对照组的th阳性细胞(箭头)减少，但注射mir?181a/b的鱼却没有。比例尺为100μm。[0107](b’?d’)b?d的较高放大倍数。比例尺为40μm。[0108]e)th阳性细胞/蓝斑核数(以％表示)。n＝6，**p<0.01，具有事后tukey分析的单向方差分析；误差线是sem。[0109]图9.mir?181a/b?1的失活改善了6?ohda诱导的pd小鼠模型的表型。[0110](a?c)在黑质(sn)中单侧注射6?ohda的mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠大脑的抗th免疫组织化学染色。[0111](a，b)在mir?181a/b?1+/+小鼠中，6?ohda注射导致sn相对于对照生理盐水注射侧的th阳性细胞减少(a)，而在mir?181a/b?1?/?动物中，da神经元(箭头)免受6?ohda诱导的死亡。(b)。[0112](c，d)相对于对照盐水注射侧(c)，在6?ohda注射侧的mir?181a/b?1+/+小鼠的纹状体部分中th染色减少，这与在mir?181a/b?1?/?小鼠中注射6?ohda侧和对照侧之间无差异(d)相反。比例尺为1mm。[0113]e)sn中th阳性细胞/切片的数量报告为倍数变化，对照半球对于每种小鼠基因型对应于1。n＝6。[0114]f)l?dopa诱导的旋转测试测量了注射6?ohda的mir?181a/b?1+/+小鼠的行为和运动缺陷。注射6?ohda的mir?181a/b?1?/?对旋转诱导的l?dopa效应较不敏感。在每个时间间隔(t1＝0?600s，t2＝600?1200s，t3＝1200?1800s，t4＝1800?2400s)分析净对侧旋转(对侧?同侧旋转)。n＝8。*p<0.05，***p<0.001e中的单因素方差分析和事后tukey分析，f中的基因型效应的两因素方差分析用于重复测量；误差线是sem。[0115]图10.mir?181a/b?1簇占据了小鼠脑和眼睛中大部分mir?181a和mir?181b表达。[0116]a，b)mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠的视网膜(a)和黑质(sn)(b)切片中的mir?181a和mir?181b探针的rna原位杂交。比例尺在(a)中为50μm，在(b)中为1mm。[0117]c，d)通过taqman实验对mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?眼和脑中的mir?181a和mir?181b进行表达分析。mir?181a/b簇?1的靶向缺失导致两种组织中mir?181a和mir?181b成熟形式的表达水平均显著降低。n＝3***p<0.005单尾斯氏t检验；误差线是sem。[0118]e)mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠脑切片的nissl染色显示，与对照组相比，mir?181a/b?1?/?小鼠不显示明显的形态学差异。比例尺为1mm。onl，外核层；inl，内核层；gcl，神经节细胞层。[0119]图11.mir?181a/b?1缺失导致自噬通量增加。[0120]a)qrt?pcr显示mir?181a/b?1?/?相对于mir?181a/b?1+/+动物眼中mir?181a/b靶标bcl2,mcl1,xiap,atg5,erk2和park2的上调。n≥5只动物/基因型。[0121]b)在饱食和饥饿的条件下获自动物眼的蛋白提取物上的lc3?i/lc3?ii和p62的wb分析(左图)，结果显示mir?181a/b?1?/?(?/?)相对于mir?181a/b?1+/+(+/+)小鼠中的这两种蛋白质水平都有所减少(右图中定量)。对于每种基因型和条件，n＝2只小鼠。误差线为sem。[0122]c)qrt?pcr分析显示在喂食和饥饿条件下mir?181a/b?1?/?和mir?181a/b?1+/+小鼠眼中sqstm1(p62)和map1lc3b(lc3)转录水平没有变化。这些数据表明，通过wb分析观察到的自噬标记物lc3?ii和p62水平降低是由于mir?181a/b?1?/?眼中自噬通量的增加。每个基因型和条件n＝3。**p<0.01***p<0.001单尾斯氏t?检验。[0123]图12.mir?181a/b沉默保护sh?sy5y细胞免受fccp诱导的细胞死亡。[0124]细胞死亡分析显示，mir?181a/b沉默(100nm)保护sh?sy5y细胞免受fccp处理的影响。n＝3个独立实验。**p<0.01,双尾斯氏t?检验。误差线为sem。[0125]图13.青鳉鱼中的mir?181a/b敲低(knockdown)导致与线粒体功能和线粒体自噬有关的基因上调。[0126]对从整个mir?181a/b?mos青鳉鱼胚胎中提取的总rna进行qrt?pcr，以分析涉及线粒体依赖性细胞死亡中(bcl2，mcl1)，线粒体自噬(atg5，erk2)，和线粒体的生物发生和功能(cox11，coq10b，prdx3)的mir?181a/b靶标和间接靶标ppargc1a的转录水平。n＝3**<0.05；***<0.005单尾斯氏t检验；误差线是sem。[0127]图14.mo介导的mir?181a/b沉默和给药后无异常表型[0128](a，b)仅注射mir?181a/b?mos的青鳉鱼胚胎(b)与对照胚胎(a)相比没有表型差异。[0129](c?e)在该研究中使用的浓度下，巴佛洛霉素(bafilomycin)a(baf?a1)(c)，pd98059(d)和ha14?1(e)不会在对照胚胎中诱导任何形态变化。比例尺为100μm。(f)如lc3?i/ii wb分析所示，用于该研究的巴佛洛霉素a的浓度可阻止自噬。[0130]图15.mir?181a/b?1缺失不会引起小鼠视网膜形态和功能显著改变。[0131](a?j)不同视网膜标志物的免疫荧光染色[(a，b)视杆细胞的视紫红质(rhod)；(c，d)视锥细胞的视锥?抑制蛋白(c?arr)；(e，f)rgc和无长突细胞的pax6；(g，h)muller细胞的gs6；(i，j)内丛状层中突触结构的突触融合蛋白(synt)]揭示，相对于对照小鼠而言mir?181a/b?1?/?的视网膜中细胞层组织无异常。比例尺为50μm。[0132]k，l)视网膜电图分析显示mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠在a波(k)和b波(l)模式上没有差异，表明mir?181a/b消除不会引起视网膜功能异常。每个基因型n＝10。[0133]m)rgc/mm数量的图形表示(表示为％)显示mir?181a/b?1+/+和mir?181a/b?1?/?小鼠之间无显著差异。每个基因型n＝10。onl，外核层；opl，外丛状层；inl，内核层；ipl，内丛层；gcl，神经节细胞层。[0134]图16.mir?181a/b抑制作用降低amd体外模型中脂褐素(a2e)的累积。[0135]a)用对照lna和lna?mir?181a/b转染然后用a2e处理的arpe?19细胞的共聚焦图像。自体荧光分析显示a2e累积量，且表明与对照细胞相比，mir?181a/b抑制减少a2e累积。b)与对照细胞相比的，lna?mir?181a/b转染的细胞中每个细胞的a2e自发荧光强度，a2e spot强度和a2e spot面积的定量图示，报告为倍数变化。斯氏t检验p值***<0.001,**<0.005[0136]图17.mir?181a/b耗竭减少了abca4?/?/小鼠中脂褐素(a2e)的累积[0137]a)abca4?/?/mir?181a/b?1?/?rpe内mir?181a/b靶标sod1和cat1转录本的qrt?pcr分析。b)abca4?/?和abca4?/?/mir?181a/b?1?/?视网膜切片中rpe和pos内的脂褐素累积的代表性图示。c)rpe和pos中的脂褐素自发荧光定量。误差线为sem。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。[0138]图18.mir?181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的视觉功能。[0139]p347s和p347s/mir?181a/b+/?小鼠在p30时的erg反应突出显示了mir?181a/b杂合耗竭动物中的改善。n＝16,**p<0,01；***p<0,001。[恒定亮度(cd·s/m2)，明视＝2.4log cd·s/m2][0140]图19.mir?181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的感光细胞标志物表达。[0141]a)用两种不同的视网膜标记物(绿色)，视紫红质和视锥抑制蛋白以及dapi(蓝色)染色的p347s和p347s/mir?181a/b+/?视网膜在p30时的免疫荧光图像。b)在p347和p347s/mir?181a b+/?间的p30时的onl厚度分析。c)qrt?pcr分析揭示p347s/mir?181a/b+/?中相对于p347s小鼠视网膜在p30时主要pr标记物(视紫红质，s?视蛋白，m?视蛋白，pde6b和视锥抑制蛋白)水平升高。n＝3；误差线为sem。[0142]图20.mir?181a/b减少改善了感光细胞的外部片段长度。p347s/mir?181a/b+/?感光细胞显示外部片段(os)长度相对于p347s动物增加。*p<0.05,斯氏t?检验。误差线为sem。[0143]图21.mir?181a/b减少改善较晚时间点色素性视网膜炎小鼠模型的视觉功能。[0144]p347s和p347s/mir?181a/b+/?小鼠在p90时的erg反应突出显示了mir?181a/b杂合耗竭动物中的改善。n＝24,***p<0,001。[0145]图22.mir?181a/b减少改善色素性视网膜炎小鼠模型的感光细胞标志物表达和存活。[0146]a)用两种不同的视网膜标记物(绿色)，视紫红质和视锥抑制蛋白以及dapi(蓝色)染色的p347s和p347s/mir?181a/b+/?视网膜在p90的免疫荧光图像。b)在p347和p347s/mir?181a b+?之间的p90时的onl厚度分析，突出显示onl厚度的显著增加。c)qrt?pcr分析揭示p347s/mir?181a/b+/?中与p347s小鼠相比视网膜在p30时主要pr标记物(视紫红质，s?视蛋白，m?视蛋白，pde6b和视锥抑制蛋白)水平升高。n＝3；误差线为sem。[0147]图23.a)p347s相对于野生型眼的转录组学分析中下调的项目。[0148]b)p347s/181a/b+/?眼中多个mir?181a/b靶标(hprt，cox11，erk2，bcl2，nrf1，coq10b，atg5，xiap，pgc1a，park2，prdx3)在p30时与p347s相比的qrt?pcr分析；*p<0.05；**p<0.01，单尾斯氏t检验。误差线为sem。[0149]图24.mir?181a/b的减少降低p347s视网膜中活化的胱冬酶3。[0150]a)p30时p347s和p347s/mir?181a/b+/?的冷冻视网膜切片上的免疫荧光图像，用抗活化胱冬酶?3抗体(绿色)和dapi(蓝色)染色。该分析揭示了p347s/mir?181a/b+/?中的凋亡细胞数量少于p347s视网膜。b)手动进行抗活性胱冬酶?3阳性细胞计数。n＝5；*p<0.05,斯氏t?检验。误差线为sem。[0151]图25.mir?181a/b的减少降低p347s视网膜中tunel染色。a)冷冻视网膜的p347s和p347s/mir?181a/b+/?在p30时的tunel?pod染色。褐色斑点表示dna双链损伤或单链损伤。该分析揭示了p347s/mir?181a/b+/?小鼠中的凋亡细胞数量少于p347s/mir?181a/b+/+小鼠。b)手动进行tunel?pod阳性细胞计数。n＝3；*p<0.05,斯氏t?检验。误差线为sem。[0152]图26.mir?181a/b的减少改善p347s感光细胞中的线粒体形态。a)野生型(wt)，p347s和p347s/mir?181a/b+/?动物的视网膜在p30时的电子显微镜(em)图像；n＝2只动物/基因型。wt，p347s和p347s/mir?181a/b+/?的prs线粒体的em图像在p30时显示mir?181a/b下调的动物pr线粒体表型有所改善。b)线粒体主直径长度的量化。n＝2；*p＝0.01,斯氏t?检验。误差线为sem。[0153]图27.mir?181a/b的减少改善p347s眼中线粒体标记物的表达。a)在p30时，野生型，p347s和p347s/mir?181a/b+/?动物眼的蛋白质提取物中通过wb分析检测的mfn2蛋白水平；在d)中定量，数据对p115标准化。n＝2只动物/基因型。误差线为sem。b)通过wb分析来自p30时的野生型，p347s和p347s/mir?181a/b+/?动物眼的蛋白质提取物中ci亚基ndufb8，cii sdhb，ciii uqcrc2，civ mtc01，cv atp5a的蛋白水平。d)中蛋白质水平的定量数据对p115标准化。n＝2只动物/基因型。误差线为sem。c)在p30时，野生型、p347s和p347s/mir?181a/b+/?动物眼的蛋白质提取物中通过wb分析检测的柠檬酸合成酶蛋白水平；在d)中显示蛋白质水平定量，数据对p115标准化。n＝4只动物/基因型。d)a、b和c中所示的wb蛋白质定量的图形表示。数据对p115标准化。*p<0.05；**p<0.01,***p<0.001双尾斯氏t检验。误差线为sem。[0154]图28.mir?181a/b海绵效力的体外实验验证。[0155]a)aav2.1?cmv?egfp?mir?181海绵图。b)用aav2.1?cmv?egfp?mir?181a/b海绵(海绵181)转染48h后，sh?sy5y中mir?181a/b直接靶向转录本(xiap，nrf1，prdx3，mcl1，atg5，sirt1，bcl2，bcl2，erk2，park2，cox11)的qrt?pcr分析。在海绵181样品中，相对于对照样品(对照＝aav2.1?cmv?egfp转染的细胞)，mir?181a/b靶标的转录水平增加。n＝3。该数据表明，mir?181海绵隔离了内源性mir?181a/b，从而阻止了其直接靶标的结合并抑制了其活性。[0156]序列表中序列表的简要描述[0157]mir?181家族成员的序列比较。[0158][0159]mir?181a(seq id no.1)[0160]aacauucaacgcugucggugagu[0161]mir?181b(seq id no.2)[0162]aacauucauugcugucggugggu[0163]mir?181c(seq id no.3)[0164]aacauucaac?cugucggugagu[0165]mir?181d(seq id no.4)[0166]aacauucauuguugucggugggu[0167]mir?181种子序列(seq id no.5)[0168]acauuca[0169]lna a(seq id no.6)[0170]cgacagcgttgaatgt[0171]lna b(seq id no.7)[0172]cgacagcaatgaatgt[0173]mir?181海绵序列:(seq id no.8)[0174][0175]mir?181海绵的说明:[0176]mir?181海绵“mbs seq a”用粗体标示；mir?181海绵“mbs seq b”用下划线标注；间隔子“1”:tagc为斜体；间隔子“2”或中央间隔子:tctaga(限制性酶)[0177]mir?181海绵序列:seq id no.9[0178][0179]mir?181 海绵序列:seq id no.10[0180][0181]mir?181海绵序列:seq id no.11[0182][0183]mir?181海绵序列:seq id no.12[0184][0185]mir?181海绵序列:seq id no.13[0186][0187][0188]aav2.1 cmv?egfp?mir?181海绵序列(seq id no.14)[0189]>[aav2.1_cmv_egfp_mir?181海绵]?5838bp[0190]agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccaggcggccgccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaataagcttggatccaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtgctgcgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgagatcttctagaacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgtttagcacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgtttagcacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgtttctagaacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgtttagcacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgtttagcacccaccgacaatgctgaatgtttagcactcaccgacaatagtgaatgttagatctgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaatagtggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagtaatggtaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgcggttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag[0191]定义[0192]本文使用的术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链dna，以及三链、双链和单链rna。其还包括修饰，例如通过甲基化和/或通过加帽，以及未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2?脱氧?d?核糖)，多核糖核苷酸(含有d?核糖)，任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱基的n?或c?糖苷，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(pna))和多吗啉代(可从anti?virals，inc.corvallis,oreg商购获得，称为neugene)聚合物，和其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物包含核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆叠，例如dna和rna中发现的那样。术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”之间在长度上没有刻意区分，并且这些术语可以互换使用。因此，这些术语包括例如3'?脱氧?2'，5'?dna，寡脱氧核糖核苷酸n3'p5'氨基磷酸酯，2'?o?烷基取代的rna，双链和单链dna，以及双链和单链rna，微小rna，dna：rna杂合物以及pna与dna或rna之间的杂合物，还包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记，甲基化，“帽”，用类似物取代一种或多种天然核苷酸(例如用2?氨基腺苷，2?硫代胸苷，肌苷，吡咯并嘧啶，3?甲基腺苷，c5?丙炔基胞苷，c5?丙炔基尿苷，c5?溴尿苷，c5?氟尿苷，c5?碘尿苷，c5?甲基胞嘧啶，7?脱氮腺苷，7?脱氮鸟苷，8?氧代腺苷，8?氧代鸟苷，o(6)?甲基鸟嘌呤和2?硫代胞苷)，核苷酸间修饰，例如那些不带电荷的键(例如磷酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等)，带负电的键(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，带正电荷的键(例如氨基烷基氨基磷酸酯，氨基烷基磷酸三酯)，含有侧基部分的修饰，例如蛋白质(包括核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚l?赖氨酸等)，具有嵌入剂的修饰(例如吖啶，补骨脂素等)，包含螯合剂的修饰(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)，含有烷基化剂的修饰，具有修饰的键的修饰(例如α异头核酸等)，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。该术语还包括锁核酸(例如，包含在2'?氧原子和4'?碳原子之间具有亚甲基桥的核糖核苷酸)。参见例如(elayadi&corey,2001；koshkin等,1998；kurreck等,2002；obika等,1998；orum&wengel,2001)。[0193]术语“标记”和“可检测标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素，荧光剂，化学发光剂，酶，酶底物，辅酶因子，酶抑制剂，发色团，染料，金属离子，金属溶胶，配体(例如生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示荧光的物质或其部分。可与本发明一起使用的标记物的具体实例包括但不限于藻红蛋白，alexa染料，荧光素，ypet，cypet，级联蓝，别藻蓝蛋白，cy3，cy5，cy7，若丹明，丹磺酰基，伞形酮，德克萨斯红，鲁米诺，吖啶酯，生物素，绿色荧光蛋白(gfp)，增强型绿色荧光蛋白(egfp)，黄色荧光蛋白(yfp)，增强型黄色荧光蛋白(eyfp)，蓝色荧光蛋白(bfp)，红色荧光蛋白(rfp)，dronpa，mcherry，morange，mplum，venus，萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶，nadph，β?半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰转移酶，脲酶，mri造影剂(例如，钆双胺，钆贝酸，钆喷酸，钆特醇，钆磷维塞，钆弗塞胺和钆赛酸)，和计算机断层扫描(ct)造影剂(例如，重氮酸，泛影酸，碘酰胺，碘他拉酸，碘羟拉酸，碘格利酸，醋碘苯酸，碘卡酸，碘甲磺，碘奥酮，甲泛影酰胺，碘海醇，碘克沙酸，碘帕多尔，碘普罗胺，碘曲兰，碘弗索尔，碘喷托，碘克沙醇，碘美普尔，碘比醇，碘希兰，碘沙酸，碘曲西酸，碘泛酸，碘西他酸，胺碘苯丙酸钠，替巴酸和胺碘苯丙酸钙)。[0194]如本文所用，用于描述核酸分子的“重组”是指基因组，rna，mirna，cdna，病毒，半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作而与全部或部分与之天然缔合的多核苷酸不相关。[0195]与蛋白或多肽联用时，术语“重组体”指由重组多核苷酸表达产生的多肽。通常，克隆感兴趣的基因并在转化的生物中表达，如下文进一步所述。[0196]微小rna[0197]如本文所用，术语“微小rna”，“mirna”，“成熟微小rna”和“成熟mirna”是指长度为约19至约25个核苷酸的非编码单链rna分子(包括约19，约20，约21，约22，约23，约24和约25个核苷酸)，其可通过rna干扰途径(即通过与risc结合并随后降解目标mrna或翻译抑制)有效降低靶多核苷酸和多肽的表达水平。术语“微小rna”是指在任何生物(例如植物，动物)中发现的内源性mirna，也包括人工mirna，其包括长度为约19?25个核苷酸的单链rna分子，这些分子不是在内源性mirna中发现的通过rna干扰有效减少目标多核苷酸表达的mirna。[0198]根据其靶向特性，将微小rna分为多个家族，这些特性主要取决于其延伸的种子区域(mirna核苷酸2?8)的身份。同一种子家族的成员通常是进化相关的，而进化相关的mirna通常是同一种子家族的成员。但是如(bartel，2018)中所述，“家族”一词的使用并不严格表示共同祖先。[0199]本发明的mirna属于mirna的mirna 181家族。[0200]如本文所定义，mirna 181是一组具有相同种子序列的mirna，即[0201]acauuca(seq id no.5)。优选所述mirna组在本文中被定义为一族mirna[0202]mir?181家族成员由位于三条独立染色体上的三个独立的初级转录本产生。每个转录本产生两条前体序列，总共六条前体序列。每个前体产生两条mirna链：引导链或5p，以及信使链或3p，共十种成熟mirna形式：mir?181a?5p,mir?181a?1?3p,mir?181a?2?3p,mir?181b?5p,mir?181b?1?3p,mir?181b?2?3p mir?181c?5p,mir?181c?3p,mir?181d?5p和mir?181d?3p。5p成熟序列在哺乳动物组织中显示最大丰度表达水平(karali等,2016)且包含相同的5’“种子”序列，提示了显著程度的功能性冗余(henao?mejia等,2013；ji等,2009)。如本文所用的六种成熟5p mirna定义为：mir?181a?1,mir?181a?2,mir?181b?1,mir?181b?2,mir?181c,和mir?181d。成熟形式的mir?181a?1和mir?181a?2，以及mir?181b?1和mir?181b?2的序列相同；与mir?181a相比，mir?181c成熟形式具有一个核苷酸差异，而与mir?181b相比，mir?181d成熟形式具有一个核苷酸差异。[0203]“靶位点”是微小rna识别的核酸序列。单个靶位点通常具有约六至约十个核苷酸。通常，靶位点位于mrna的3'utr内，但是靶位点也可以位于mrna的5'utr或编码区中。[0204]“抑制剂靶位点”是与所述抑制剂核酸互补的mirna 181的成熟序列内的序列。mirna 181序列可以是前体序列或成熟序列。优选地，mirna 181序列是成熟序列。[0205]抑制性核酸[0206]抑制性核酸包含抑制性rna和抑制性dna，例如可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。术语“抑制性核酸”是指一种核酸分子，其包含与靶核酸(例如，靶微小rna，例如seq id no.1、2、3或4所定义的任一mirna)互补并与其结合，通过空间位阻或靶标降解介导靶核酸的水平或活性下降(例如，mrna靶结合的活性)的序列。抑制性核酸的非限制性实例包括干扰rna，shrna，sirna，核酶，安塔够妙(antagomir)，lna，mir海绵和反义寡核苷酸。本文描述了制备抑制性rna的方法。制备抑制性核酸的其他方法是本领域已知的。[0207]本文所用的“干扰rna”是指任何双链或单链rna序列，能够通过介导rna干扰直接或间接(即，在转化时)抑制或下调基因表达。干扰rna包括但不限于小干扰rna(“sirna”)和小发夹rna(“shrna”)。“rna干扰”是指序列相容的信使rna转录本的选择性降解。[0208]如本文所用，“shrna”(小发夹rna)是指包含反义区域，环部分和正义区域的rna分子，其中正义区域具有与反义区域碱基配对以形成双链体茎的互补核苷酸。[0209]转录加工后，小发夹rna通过dicer酶介导的切割事件被转化为小干扰rna，该酶是核酸酶iii家族的成员。[0210]如本文所用，“小干扰rna”或“sirna”是指能够通过以序列特异性方式介导rna干扰来抑制或下调基因表达的任何小rna分子。小rna可以是例如约18至21个核苷酸长。[0211]如本文所用，“安塔够妙(antagomir)”是指与特定的微小rna靶标具有互补性的小合成rna，其任选地在切割位点错配或具有一种或多种碱基修饰以抑制切割。[0212]如本文所用，短语“转录后加工”是指在转录后发生并且例如由dicer和/或drosha酶介导的mrna加工。[0213]在本文所述的治疗方法中有用的抑制剂包括抑制性核酸分子，其降低seq id no.1、2、3或4或其组合的任何微小rna(例如，成熟的微小rna或前体微小rna)的表达或活性。[0214]可用于本发明方法和组合物中的抑制性核酸包括反义寡核苷酸，核酶，外部引导序列(egs)寡核苷酸，sirna化合物，单链或双链rna干扰(rnai)化合物，例如sirna化合物，修饰的碱基/锁核酸(lna)，安塔够妙(antagomir)，肽核酸(pna)和其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物，它们与目标核酸的至少一部分杂交并调节其功能。在一些实施方案中，抑制性核酸包括反义rna，反义dna，嵌合反义寡核苷酸，包含修饰键的反义寡核苷酸，干扰rna(rnai)，短干扰rna(sirna)；微小干扰rna(mirn a)；时序调节微小rna(strna)；或短发夹rna(shrna)；小rna诱导的基因激活(rnaa)；小活化rna(sarna)或其组合。参见例如,wo2010/040112。[0215]在一些实施方案中，抑制性核酸的长度为10至50、13至50或13至30个核苷酸。本领域普通技术人员将意识到，这体现了具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长度或其中的任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物的长度为12或13至30个核苷酸。本领域普通技术人员将理解，这体现了具有反义部分长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围的抑制性核酸。[0216]在一些实施方案中，抑制性核酸是包含两个或更多个化学上不同的区域的嵌合寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通常包含至少一个赋予一个或多个有益特性的修饰核苷酸区域(例如，增加的核酸酶抗性，增加的细胞摄取，增强的对靶标的结合亲和力)和一个作为能够切割rna：dna或rna：rna杂合物的酶的底物的区域。如上所述，本发明的嵌合抑制核酸可以形成为两个或更多个寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这样的化合物在本领域中也被称为杂合体或间隔体(gapmer)。教导制备这种杂合物结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自通过引用并入本文。[0217]在一些实施方案中，抑制性核酸包含在糖的2'位置被修饰的至少一个核苷酸，最优选为2'?0?烷基，2'?0?烷基?0?烷基或2'?氟修饰的核苷酸。在其他优选的实施方案中，rna修饰包括在rna的3'末端反向碱基或嘧啶、碱性残基的核糖上的2'?氟，2'?氨基和2'o?甲基修饰。此类修饰常规掺入寡核苷酸，并且已显示出这些寡核苷酸相对于针对给定靶标的2'?脱氧寡核苷酸具有更高的tm(即，更高的靶标结合亲和力)。[0218]已经显示出许多核苷酸和核苷修饰使得掺入它们的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶消化的抵抗力更高—修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。修饰寡核苷酸的具体实例包括那些包含修饰骨架的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯，磷酸三酯，甲基膦酸酯，短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是ch2?nh?0?ch2，ch，～n(ch3)～0～ch2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链)，ch2?o?n(ch3)?ch2，ch2?n(ch3)?n(ch3)?ch2和o?n(ch3)?ch2?ch2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为o?p?o?ch，)；酰胺骨架(参见(de mesmaeker等，1995)；吗啉代骨架结构(参见美国专利号5,034,506)；肽核酸(pna)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代，核苷酸直接或间接结合到聚酰胺主链的氮杂氮原子上，参见(nielsen等，1991)。含磷的键包括但不限于硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，包含3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯，次膦酸酯，包含3'?氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯的氨基膦酸酯，具有正常3’?5’连接键的硫代氨基磷酸酯，硫代烷基氨基磷酸酯，硫代烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯，其2'?5'连接类似物，以及具有极性反转的那些，其中相邻的核苷单元对以3'?5'至5'?3'或2'?5'至5'?2'连接；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050(各自在此引入以供参考)。基于吗啉代的寡聚化合物描述于(braasch&corey，2002；heasman，2002；lacerra等，2000；nasevicius&ekker，2000)和美国专利号5,034,506。(wang等，2000a)中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。[0219]不包含磷原子的修饰寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间混合键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃的主链；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的n，o，s和ch2成分的部分；参见美国专利号：5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439(各自在本文引入以供参考)。[0220]也可以包括一个或多个取代的糖部分，例如2'位的以下之一：oh，sh，sch3，f，ocn，och3 och3，och3o(ch2)n ch3、o(ch2)n nh2或o(ch2)n ch3，其中n为1至约10；c1–c10低级烷基，烷氧基烷氧基，取代的低级烷基，烷芳基或芳烷基；cl；br；cn；cf3；ocf3；o?，s?或n?烷基；o?，s?或n?烯基；soch3；so2ch 3；ono2；no2；n3；nh2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；rna切割基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸和具有类似性质的其他取代基的药效性质的基团。优选的修饰包括2'?甲氧基乙氧基[2'?o?ch2ch2och3，也称为2'?o?(2?甲氧基乙基)](martin，1995)。其它优选修饰包括2'?甲氧基(2'?0?ch3),2'?丙氧基(2'?och2 ch2ch3)和2'?氟(2'?f)。也可以在寡核苷酸的其他位置，特别是在3'末端核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置进行类似的修饰。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，例如取代戊呋喃糖基的环丁基。[0221]抑制性核酸还可以额外或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰的”或“天然”核碱基包括腺嘌呤(a)，鸟嘌呤(g)，胸腺嘧啶(t)，胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中很少或瞬间出现的核碱基，例如次黄嘌呤，6?甲基腺嘌呤，5?me嘧啶，特别是5?甲基胞嘧啶(也称为5?甲基?2'脱氧胞嘧啶，通常在本领域称作5?me?c)，5?羟甲基胞嘧啶(hmc)，糖基hmc和龙胆二糖基hmc，以及合成的核碱基，例如2?氨基腺嘌呤，2?(甲基氨基)腺嘌呤，2?(咪唑基烷基)腺嘌呤，2?(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤，2?硫尿嘧啶，2?硫胸腺嘧啶，5?溴尿嘧啶，5?羟甲基尿嘧啶，8?氮杂鸟嘌呤，7?脱氮鸟嘌呤，n6(6?氨基己基)腺嘌呤和2,6?二氨基嘌呤。见kornberg,a.,dna replication,w.h.freeman&co.,san francisco,1980,pp75?77；和(gebeyehu等,1987)。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已显示5?me?c取代可将核酸双链体稳定性提高0.6?1.2℃(anghvi,y.s.,in crooke,s.t.and lebleu,b.,eds.,antisense research and applications,crc press,boca raton,1993,pp.276?278)，是目前优选的碱基取代。[0222]给定寡核苷酸中的所有位置不必均一地修饰，并且实际上可以将多个上述修饰中的一个以上掺入单个寡核苷酸中，或者甚至在寡核苷酸内的单个核苷内。[0223]在一些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间键合，即骨架，都被新的基团取代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已显示出具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架例如氨基乙基甘氨酸骨架取代。核碱基被保留并直接或间接结合到骨架酰胺部分的氮杂氮原子上。教导pna化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。pna化合物的进一步教导可以在(nielsen等，1991)中找到。[0224]抑制性核酸还可以包括一个或多个核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基：腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，和嘧啶碱基：胸腺嘧啶(t)，胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，例如5?甲基胞嘧啶(5?me?c)，5?羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2?氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6?甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2?丙基和其他烷基衍生物，2?硫尿嘧啶，2?硫胸腺嘧啶和2?硫胞嘧啶，5?卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5?丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6?偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5?尿嘧啶(假?尿嘧啶)，4?硫尿嘧啶，8?卤代、8?氨基、8?硫醇、8?硫代烷基、8?羟基和其8?取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5?卤代，特别是5?溴，5?三氟甲基等5?取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7?甲基奎宁和7?甲基腺嘌呤，8?氮杂鸟嘌呤和8?氮杂腺嘌呤，7?脱氮鸟嘌呤和7?脱氮杂腺嘌呤，3?脱氮鸟嘌呤和3?脱氮杂腺嘌呤。[0225]此外，核碱基包括在以下文献中公开的那些：美国专利号3,687,808,在'the concise encyclopedia of polymer science and engineering'(《聚合物科学和工程简明百科全书》),858?859页,kroschwitz,j.i.,编john wiley&sons,1990公开的那些,englisch等,angewandle chemie,国际版',1991,30,pp.613公开的那些,以及sanghvi,y.s.,15章,反义研究和应用，pp.289?302,crooke,s.t.和lebleu,b.ea.,crc press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5?取代的嘧啶，6?氮杂嘧啶和n?2，n?6和o?6取代的嘌呤，其包含2?氨基丙基腺嘌呤，5?丙炔基尿嘧啶和5?丙炔基胞嘧啶。已显示5?甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6?1.2℃(sanghvi,y.s.,在crooke,s.t.和lebleu,b.,编的“antisense research and applications”(反义研究及应用),crc出版社(crc press),boca raton,1993,pp.276?278)，是目前优选的碱基取代，当与2?o?甲氧基乙基糖修饰组合时尤其优选。修饰的核碱基如以下所述：美国专利号3,687,808,以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692,和5,681,941(各自在此引入以供参考).[0226]在一些实施方案中，抑制性核酸与增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接。这些部分包括但不限于脂类部分，例如胆固醇部分(letsinger等,1989),胆酸(manoharan等,1994),硫醚，例如己基?s?三苯甲基硫醇(manoharan等,1992；manoharan等,1993),硫代胆固醇(oberhauser&wagner,1992),脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(kabanov等,1990；svinarchuk等,1993),磷脂，例如二?十六烷基外消旋甘油或1,2?二?o?十六烷基外消旋甘油?3?h?磷脂三乙基铵(manoharan等,1995；shea等,1990),聚胺或聚乙二醇链(mancharan等,nucleosides&nucleotides 14:969?973,1995),或金刚烷乙酸(manoharan等,1995),棕榈酰基部分(mishra等,1995),或十八烷胺或己基氨基?羰基?叔氧基胆固醇部分(crooke等,1996)。还可参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(各自在本文引入以供参考)。[0227]这些部分或缀合物可包括与官能团例如伯或仲羟基共价结合的缀合基团。本发明的缀合基团包括嵌入剂，报道分子，聚胺，聚酰胺，聚乙二醇，聚醚，增强寡聚物的药效学性质的基团和增强寡聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇，脂类，磷脂，生物素，吩嗪，叶酸，菲啶，蒽醌，吖啶，荧光素，罗丹明，香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善摄取，增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明化合物的摄取，分布，代谢或排泄的基团。代表性缀合基团公开于国际专利申请号pct/us92/09196,于1992年10月23日提交，和美国专利号6,287,860,其引入本文以供参考。缀合部分包括但不限于脂类部分，例如胆固醇部分,胆酸,硫醚，例如己基?5?三苯甲基硫醇,硫代胆固醇,脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基,磷脂，例如二?十六烷基外消旋甘油或1,2?二?o?十六烷基外消旋甘油?3?h?磷脂三乙基铵,聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸,棕榈酰基部分,或十八烷胺或己基氨基?羰基?氧基胆固醇部分。可参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(各自在此引入以供参考)。[0228]可用于本发明方法的抑制性核酸与靶mirna充分互补，即，充分良好地杂交并具有足够的特异性，以产生所需的效果。“互补的”是指通过氢键在包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的两个序列之间配对的能力。例如，如果抑制性核酸在一个位置的碱基能够与mirna对应位置的碱基氢键键合，则认为该碱基在该位置处彼此互补。在一些实施方式中，不需要100％互补。在一些实施方式中，需要100％互补。可以使用常规方法来设计以足够的特异性结合靶序列的抑制性核酸。[0229]尽管本文阐述了某些示例性靶片段的具体序列，但是本领域技术人员将认识到，这些序列用于举例说明和描述本发明范围内的特定实施方案。鉴于本公开，本领域普通技术人员可以容易地识别其他目标片段。长度为5、6、7、8、9、10或10个以上核苷酸的靶片段，包括在种子序列内或与其紧邻的至少五(5)个连续核苷酸的片段，也被认为也适用于靶向。在一些实施方案中，靶片段可以包括包含来自种子序列的5'末端的至少5个连续核苷酸的序列(其余核苷酸是同一rna的连续片段，从种子序列5'端的上游开始，一直持续到抑制性核酸含有约5至约30个核苷酸为止)。在一些实施方案中，靶片段由rna序列表示，所述rna序列包含来自种子序列之一的3'?末端的至少5个连续核苷酸(其余核苷酸是相同mirna紧接在3'下游开始的连续片段。片段的末端并持续直到抑制性核酸含有约5至约30个核苷酸)。配备本文提供的序列的本领域技术人员将能够在无需过度实验的情况下识别出要靶向的其他优选区域。在一些实施方案中，抑制性核酸包含与靶标内至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸互补的序列(例如，靶标mirna，例如成熟或前体mir?181，或靶标mrna)。[0230]一旦鉴定出一个或多个靶区域，区段或位点，就选择与靶标充分互补的抑制性核酸化合物，即与靶标充分杂交并具有足够特异性(即基本上不与其他非靶rna结合)，以达到理想的效果。在本发明的上下文中，杂交是指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键，其可以是watson?crick，hoogsteen或反向hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。如本文所用，互补是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸特定位置的核苷酸能够与mirna分子或mrna分子的相同位置的核苷酸氢键合，则认为抑制性核酸和该mirna或mrna在那个位置彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此氢键结合的核苷酸占据时，抑制性核酸与该mirna或mrna彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够程度的互补性或精确配对的术语，从而在抑制性核酸和mirna靶标之间发生稳定和特异性的结合。例如，如果抑制性核酸在一个位置的碱基能够与mirna或mrna对应位置的碱基氢键键合，则认为该碱基在该位置处彼此互补。不需要100％的互补性。[0231]本领域中应理解，互补核酸序列的可特异性杂交并不要求其与靶核酸的序列100％互补。当序列与靶标mirna或mrna分子的结合干扰靶标mirna或mrna的正常功能从而导致表达或活性丧失时，用于本方法目的的互补核酸序列可特异性杂交，并且存在足够程度的互补性，以避免在需要特异性结合的条件下，例如在体内测定或治疗的生理条件下，在体外测定的情况下在适当的严格条件下进行测定的条件下，序列与非靶rna序列的非特异性结合。例如，严格的盐浓度通常为小于约750mm nacl和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mm nacl和50mm柠檬酸三钠，更优选小于约250mm nacl和25mm柠檬酸三钠。在没有有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下可以获得低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺，更优选至少约50％的甲酰胺的存在下可以获得高严格度杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。可变的其他参数，例如杂交时间，去污剂(例如十二烷基硫酸钠(sds))的浓度以及载体dna的包含或排除，是本领域技术人员众所周知的。根据需要组合这些各种条件来实现各种严格程度。在一个优选的实施方案中，杂交将在30℃在750mm nacl，75mm柠檬酸三钠和1％sds中进行。在一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃下在500mm nacl，50mm柠檬酸三钠，1％sds，35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精dna(ssdna)中进行。在一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃下在250mm nacl，25mm柠檬酸三钠，1％sds，50％甲酰胺和200μg/ml ssdna中进行。在这些条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。[0232]对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格性也将会有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来限定。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度可为优选小于约30mm nacl和3mm柠檬酸三钠，最优选小于约15mm nacl和1.5mm柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，和甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃在30mm nacl，3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃在15mm nacl，1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃在15mm nacl，1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。对这些条件的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术对于本领域技术人员是熟知的，例如在以下所述：{benton,1977；grunstein,1975和ausubel等.(《分子生物学最新方法》(current protocols in molecular biology),wiley interscience出版公司,纽约(new york),2001)；berger和kimmel(《分子克隆技术指南》(guide to molecular cloning techniques),1987,学术出版社(academic press,纽约)；和sambrook等,《分子克隆实验手册》(molecular cloning:a laboratory manual),纽约冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press,new york)。[0233]通常，可用于本文描述的方法的抑制性核酸与靶核酸内的靶区域具有至少80％的序列互补性，例如与mirna内的靶区域具有90％，95％或100％的序列互补性。例如，其中反义寡核苷酸的20个核碱基中的18个是互补的并且因此可与靶区域特异性杂交的反义化合物将具有90％的互补性。抑制性核酸与靶核酸区域的互补性百分数可使用碱基局部比对搜索工具(blast程序)常规确定(altschul，1990；zhang，1997)。通过常规实验鉴定与mirna或mrna杂交的本发明的反义和其他化合物。通常，抑制性核酸必须保留对其靶标的特异性，即，不得与预期靶标以外的转录本直接结合或直接显著影响其表达水平，其中所述预期靶标可以是一种或多种属于同一家族或不同家族的mirna。[0234]对于抑制性核酸的进一步公开，可参见us2010/0317718(反义寡聚物)；us2010/0249052(双链核酸(dsrna))；us2009/0181914和us2010/0234451(lna)；us2007/0191294(sirna类似物)；us2008/0249039(修饰的sirna)；和wo2010/129746和wo2010/040112(抑制性核酸)。[0235]反义[0236]反义寡核苷酸通常被设计成通过与靶标结合并在转录，翻译或剪接水平上停止表达来阻断dna或rna靶标的表达。本发明的反义寡核苷酸是设计成在严格条件下与靶标微小rna或靶标炎症标记物mrna杂交的互补核酸序列。因此，选择与靶标充分互补的寡核苷酸，即充分杂交并具有足够特异性以产生所需效果的寡核苷酸。[0237]修饰的碱基/锁核酸(lna)[0238]在一些实施方案中，本文所述方法中使用的抑制性核酸包含一个或多个修饰的键或碱基。修饰的碱基包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，肽核酸或锁核酸(lna)分子。[0239]lna是修饰的核糖核苷酸，其在核糖糖部分的2'和4'碳之间包含一个额外的桥，导致“锁”构象，从而增强了热稳定性。因此，lna包括一类双环rna类似物，其中糖磷酸骨架中的呋喃糖环通过引入2'?o，4'?c亚甲基桥被化学锁定在模仿n型(c3'?内)构象的rna中。所述修饰增加了核酸酶抗性和反义寡核苷酸对其同源mirna的结合亲和力。[0240]优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括α?l?lna。lna包含核糖核酸类似物，其中核糖环被2'?氧和4'?碳之间的亚甲基桥“锁定”，即含有至少一种/个lna单体，即一个2'?0,4’?c?亚甲基?d?呋喃核糖基核苷酸的寡核苷酸。lna碱基形成标准的watson?crick碱基对，但是锁构型增加了碱基配对反应的速率和稳定性(jepsen等，2004)。与dna相比，lna与rna碱基对的亲和力也有所提高。这些性质使得lna特别可用作荧光原位杂交(fish)和比较基因组杂交的探针，作为mirna敲低工具，以及作为靶向mrna或其他rna(例如本文所述的mirna和mrna)的反义寡核苷酸。[0241]lna分子可以包括在每条链中包含10?30，例如12?24，例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的分子，其中链中的一条与mirna或mrna中的靶区域基本相同，例如，至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或100％相同，例如具有3,2,1,或0个错配核苷酸。lna分子可以使用本领域已知的方法化学合成。[0242]可以使用本领域已知的任何方法设计lna分子，许多算法是已知的，并且是市售的(例如，在互联网上，例如在exiqon.com上)。参见例如(levin等,2006；mctigue等,2004；you等,2006)。例如，类似于用于设计反义寡核苷酸的“基因漫步”方法可用于优化lna的抑制活性；例如，可以制备一系列跨越靶mirna或mrna长度的10?30个核苷酸的寡核苷酸，然后测试活性。[0243]任选地，可以在lna之间留下缺口,例如5?10个核苷酸或更多的缺口，以减少合成和测试的寡核苷酸的数量。gc含量优选在约30?60％之间。设计lna的通用方针在本领域中是已知的；例如，lna序列将与其他lna序列非常紧密地结合，因此优选避免lna内的显著互补性。在可能的情况下，应避免三个或更多g或c，或四个以上lna残基的连续运行(例如，使用非常短的寡核苷酸(例如约9?10nt)可能无法实现)。在一些实施方式中，lna是木糖?dna。[0244]在一些实施方案中，可以将lna分子设计为靶向mipvna的特定区域。例如，可以靶向特定功能区，例如包含种子序列的区域。另外或另选地，可以靶向高度保守的区域，例如，通过比对来自诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠)的不同物种的序列鉴定的区域，并寻找具有高度同一性的区域。可以使用碱基局部比对搜索工具(blast程序)(altschul等，1990；zhang&madden，1997)(altschul等，j.mol.biol.215：403?410，1990；zhang和madden，genome res。7：649?656，1997)，例如，使用默认参数确定同一性百分比。[0245]其它有关lna的信息见美国专利号6,268,490；6,734,291；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,060,809；7,084,125；和7,572,582；和美国授权前公开号2010/0267018；2010/0261175；和2010/0035968；koshkin等,tetrahedron 54:3607?3630,1998；obika等,tetrahedron lett.39:5401?5404,1998；jepsen等,oligonucleotides 14:130?146,2004；kauppinen等,drug disc.today 2(3):287?290,2005；和ponting等,cell 136(4):629?641,2009,"锁核酸(locked nucleic acids)"(lnas),j am chem soc.2002年5月29日；124(21):5974?82.“rna的锁核酸(lna)识别：lna:rna杂交子的nmr解析结构(locked nucleic acid(lna)recognition of rna:nmr solution structures of lna:rna hybrids)”.petersen m1,bondensgaard k,wengel j,jacobsen jp；handb exp pharmacol.2006；(173):405?22.“锁核酸：rna组学的互补rna的高亲和力靶标(locked nucleic acid:high?affinity targeting of complementary rna for rnomics)”kauppinen s1,vester b,wengel j.；rna biol.2009年7?8月；6(3):321?3.epub 2009年7月18日。[0246]“作为一类新治疗剂的锁核酸(locked nucleic acid as a novel class of therapeutic agents)”veedu rn1,wengel j.chem biodivers.2010年3月；7(3):536?42.doi:10.1002/cbdv.200900343.“锁核酸：用于治疗应用的有希望的核酸类似物。(locked nucleic acids:promising nucleic acid analogs for therapeutic applications).”veedu rn1,wengel j.curr opin mol ther.2001年6月；3(3):239?43.；“锁核酸：用于基因功能分析和反义药物开发的有前途的分子家族(locked nucleic acids:a promising molecular family forgene?function analysis and antisense drug development)”.orum h1,wengel j.和其中引用的文献。[0247]还参见ussn 61/412,862，其通过引用整体并入本文。[0248]另外，反义寡核苷酸可包含肽核酸(pna)，其包含基于肽的骨架而不是糖?磷酸骨架，例如磷酸脱氧核糖骨架被n?(2?氨基乙基)?甘氨酸单元的聚酰胺链取代(fabani，mm；abreu?goodger，c.；williams，d.；lyons，pa；torres，ag；smith，kg；enright，aj；gait，mj；vigorito，e.肽核酸在体内有效抑制mir?155的功能(efficient inhibition of mir?155function in vivo by peptide nucleic acids.)，nucleic acids res.2010,38，4466?4475)。反义寡核苷酸可包含一种或多种化学修饰，包括但不限于糖修饰，例如2'?o?烷基(例如2'?o?甲基，2'?o?甲氧基乙基)，2'?氟和4'硫代修饰以及骨架修饰，例如一个或多个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸酯键(参见，例如，美国专利号6,693,187和7,067,641，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2'?o?甲氧基乙基“缺口聚合物(gapmer)”，其在5'和3'末端均包含2'?o?甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸，中心具有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚合物”能够触发rna酶h依赖性的rna靶标降解机制。反义寡核苷酸的其他增强稳定性和提高功效的修饰，例如美国专利号6,838,283所述的(其通过引用整体并入本文)在本领域中是已知的，并且适用于本发明的方法。[0249]本发明的其他反义寡核苷酸包括小rna拉链。[0250]用于抑制微小rna活性的反义寡核苷酸的长度为约19至约25个核苷酸。反义寡核苷酸可包含与成熟和/或前体mirna序列至少部分互补的序列，例如至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与成熟和/或前体mirna序列互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与成熟和/或前体mirna序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列至少约95％，96％，97％，98％或99％互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与成熟和/或前体mirna序列100％互补的序列。[0251]本发明的反义核苷酸可以靶向mir?181的序列，包括但不限于mir?181a(seq id no.1)，mir?181b(seq id no.2)，mir?181c(seq id no.3)或mir?181d(seq id no.4)或其组合。[0252]本发明优选的反义核苷酸是锁核酸，其包含与seq id no 1或3的成熟mir?181a序列至少部分互补的序列，例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与所述mirna序列互补并靶向mirna 181a和/或mir?181c。[0253]本发明还优选的反义核苷酸是锁核酸，其包含与seq id no 2或4的成熟mir?181a序列至少部分互补的序列，例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与所述mirna序列互补并靶向mirna 181b和/或mir?181d。[0254]特别优选的锁核酸包含seq id no.1、2、3或4，并在一个或多个核苷酸处被修饰。[0255]本发明的优选实施方案包括靶向mir?181a/c和mir?181b/d的lna的组合，特别优选的实施方案包括如本文所述的lna a(seq id no.6)和lna b(seq id no.7)的组合。[0256]antagomir(安塔够妙)[0257]在一些实施方案中，反义序列是安塔够妙(antagomir)(krutzfeldt，j；rajewsky，n.；braich，r.；rajeev，kg；tuschl，t.；manoharan，m.；stoffel，m.用安塔够妙(antagomir)在体内沉默微小rna(silencing of micrornas in vivo with'antagomirs'"),nature 2005，438，685–689)。安塔够妙(antagomir)是靶向微小rna(例如，靶向hsa?mir?181)的化学修饰的反义寡核苷酸。例如，用于本文描述的方法的安塔够妙(antagomir)可包括充分互补以与约12至25个