一种利用3D肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法与流程

　　一种利用3d肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法技术领域1.本发明属于遗传毒性检测领域，具体涉及一种利用3d肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法。背景技术：2.当前3d细胞培养技术在毒理学研究中具有较大的发展潜力。由于科研领域对于动物伦理学日益重视，使用3d细胞培养技术符合“减少、替代、优化”3r原则的要求。并且由于药物毒性评价常用的实验动物(如啮齿类)与人类存在种属差异，使用人源化细胞模型进行药物毒性评价可以在药物早期筛选阶段提供更多与人相关的参考数据，缩短研发时间和降低研发成本。目前已用于遗传毒性试验的3d细胞模型包括3d皮肤模型、3d肝模型、3d气道模型等。由于药物通常经过口服及注射进入人体，在肝脏中进行代谢，因此开发一种3d肝细胞模型能在体外模拟药物在体内的代谢，并满足大部分药物的体外遗传毒性筛选需求，展示了巨大的发展前景。3.与已发表文献中的cbmn法相比，本发明采用了旨在捕获多种导致染色体损伤和染色体不稳定的多个分子事件的胞质分裂阻滞微核细胞组学(cytokinesis?block micronucleus cytome,cbmn?cyt)方法。cbmn只计数双核微核，而cbmn?cyt法需要计数双核细胞的微核、核芽、核质桥。4.微核(micronucleus,mn)来源于细胞分裂后期落后的染色体片段或整条染色体。胞质分裂阻滞微核(cytokinesis?block micronucleus，cbmn)试验是体外人类或哺乳动物细胞中微核测定的首选方法，在cbmn试验中，用细胞松弛素b(cytochalasin b,cyto?b)阻断细胞分裂后，通过观察双核细胞，可以识别第一次分裂的细胞中的微核率。cbmn法由于其可靠性和良好的重现性，已成为人类和哺乳动物细胞遗传毒理学检测的标准方法之一。随着相关的dna损伤生物标志物微核、核质桥(nucleoplasmic bridges，npb)和核芽(nuclear buds，nbud)、细胞死亡和细胞凋亡的机制研究，这种方法最终演变成了旨在捕捉所有这些dna损伤事件的胞质分裂阻滞微核细胞组学(cytokinesis?block micronucleus cytome,cbmn?cyt)方法。cbmn?cyt检测的优点和亮点是，它允许同时检测导致染色体损伤和染色体不稳定的多个分子事件。5.mn、npb和nbud是癌症中常见的核异常现象，代表一种常见的染色体不稳定的细胞表型。染色体不稳定会导致细胞的基因量改变，并具有迅速进化和突变的潜力，从而形成各种异常的基因型(文海若,等.中国新药杂志,2016,25(7):787?793.6)。mn主要来源于无着丝粒染色体片段或在有丝分裂末期未能包含在子核中的整个染色体(miller b,et al.mutat res,1998,410(1):81?116)。mn可以敏感检测出dna损伤与修复及染色体片段和染色体丢失(文海若,等.不同肝细胞系微核细胞组学研究:中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集)。nbud的机制尚不明确，但nbud产生与dna损伤与修复相关，是扩增dna被消除过程和或dna修复复合体的生物学标志(fenech m,et al.mutagenesis,2010,26(1):125?132)。npb是dna链断裂错误而导致的双着丝粒染色体和由端粒末端融合引起的双着丝粒染色体的生物标志物(文海若,等.不同肝细胞系微核细胞组学研究，中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集)。6.丝裂霉素c(mmc)是一种抗肿瘤药物，体外微核试验为阳性。它作为一种烷基化剂可以交联互补的dna复制体，从而影响核酸的合成和功能(fenech m,et al.mutagenesis,2010,26(1):125?132)。7.目前已知的检测方案为fenech建立的人外周血淋巴细胞cbmn?cyt方案(fenech m.nature protocols,2007,2(5):1084?1104)。该cbmn?cyt方法在hepg2细胞中仅有少量应用，但缺乏标准化的试验方案。已有的建立3d肝细胞遗传毒性检测模型采用悬滴法进行培养《a three?dimensional in vitro hepg2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies》，由于营养物质减少且无法更换培养基，不适用于长期培养及后续添加试剂进行遗传毒性检测。8.常规微核细胞组学检测指标包含计数凋亡和坏死细胞数用于反映细胞毒性。由于3d细胞球体在形成过程中内部逐渐形成的坏死核心，容易对检测指标造成干扰。且已有研究证明，凋亡和坏死细胞在阳性化合物作用下，没有出现剂量相关性增加，不能很好地反应细胞毒性(maes a,et al.folia biol(praha),2012,58(5):215?220)。9.本发明使用mmc作为阳性化合物，以建立的3d肝细胞模型为实验模型，尝试建立一种3d肝细胞微核细胞组学方法，并将结果与2d细胞模型的cbmn?cyt检测结果进行对比。10.本发明建立3d肝细胞微核细胞组学方法仅对单核、双核、多核细胞进行计数，通过计算cpbi、ri、细胞生长抑制率来反映化合物对细胞造成的毒性。cbmn?cyt的细胞毒性指标100?ri与细胞生长抑制率相当，都可作为细胞增殖毒性的指标。因此本发明以建立的3d肝细胞球为实验模型，尝试建立一种3d肝细胞微核细胞组学检测方法，与人体试验结果相差大的问题，并提供与化合物相关的遗传毒性机制信息。技术实现要素：11.本发明要解决的技术问题是针对现有技术中用于检测体外细胞遗传毒性的方法与人体试验相关性差等缺陷，提供一种利用3d肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法。该检测体外细胞遗传毒性的方法更接近化合物在体内的作用，并且可以提供多种机制信息。12.为了研究细胞对物理和生化刺激的反应，2d细胞培养作为常用的体外模型已被科学界广泛接受，并且极大地加深了本发明对药物作用的理解。然而越来越多的证据表明，在一些情况下2d细胞在形态与功能方面与体内细胞有较大差距。体外毒理学研究需要复制正常组织的部分功能，用于评估外源性因素(如药物、化妆品、污染物、氧化环境)对细胞功能和致癌风险的影响。因此发明人创造性地使用3d肝细胞模型与微核细胞组学相结合建立一种新的遗传毒性评价方法，解决了本领域的技术难题，促进了体外遗传毒性检测方法的发展。13.为了更好的检测化合物的遗传毒性，提供与dna损伤相关的机制信息，发明人选择使用微核细胞组学方法进行检测。微核细胞组学检测的优点和亮点是，它允许同时检测导致染色体损伤和染色体不稳定的多个分子事件。14.本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：本发明提供一种利用3d肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法，其包括：3d细胞培养、化合物处理、制片、染色以及胞质分裂阻滞微核细胞组学法计数双核细胞的微核、核芽、核质桥中的一种或多种，所述3d细胞培养采用悬滴法和超低吸附培养方法相结合的无支架培养方法，所述无支架培养方法将悬滴培养至2～4天的细胞球体接种至超低吸附96孔板中继续培养直至第5～8天。15.在一具体实施方案中，所述无支架培养方法将悬滴培养至3天的细胞球体接种至超低吸附96孔板中继续培养直至第7天。16.在一具体实施方案中，所述3d细胞培养中的待检测细胞为人源化肝细胞hepg2细胞。17.在一具体实施方案中，所述3d细胞培养包含：18.(1)将处于对数生长期的细胞经胰酶消化；19.(2)将消化后的细胞悬液稀释到相应密度，例如2.5×105/ml；20.(3)将所述细胞悬液以20μl/滴接种至倒置的100mm培养皿盖内侧；21.(4)培养上述细胞悬液，悬滴内部形成初始接种数的细胞球体；22.(5)将步骤(4)中细胞球体转移至超低吸附培养的u形底96孔板中继续培养，隔天更换培养基。23.在一具体实施方案中，步骤(4)中所述的初始接种数为5000细胞/滴，步骤(5)中所述培养的培养时间为5～8天。较佳地，所述培养时间为7天。24.在一具体实施方案中，所述化合物处理中包含：加样、清洗、消化和离心；优选地，所述消化的处理时间为6～8min。25.在一具体实施方案中，所述制片、染色中包含：低渗处理、固定和染色；优选地，所述低渗处理的时间为3～5min。26.在一具体实施方案中，所述化合物处理的阳性对照物为dna交联并形成的加合物；较佳地，所述阳性对照物为丝裂霉素c，cas号为50?07?7。27.在一具体实施方案中，所述遗传毒性指环境中的理化因素作用于有机体，使其遗传物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上受到各种损伤，从而造成的毒性作用；优选地，所述的遗传毒性为化学物质的遗传毒性。28.在一具体实施方案中，所述化学物质为需代谢活化的遗传毒性化合物、非整倍体诱导剂、可疑遗传毒性化合物或非遗传毒性化合物；优选地，所述化学物质为苯并芘、环磷酰胺、秋水仙素、(?)?表没食子儿茶素没食子酸酯、硫代乙酸糠酯和胺碘酮。29.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。30.本发明所用试剂和原料均市售可得。31.本发明的积极进步效果在于：32.本发明成功地将3d肝细胞模型应用于微核细胞学检测，建立了3d肝细胞体外微核细胞组学检测方法，以提供与人体试验相关的更多遗传毒性信息。本方法可使用人源化肝细胞hepg2作为遗传毒性检测材料避免了使用微生物或动物细胞株进行遗传毒性检测由于种属差异使得试验数据不能进行有效的外推，并可在不加外源性代谢酶s9的情况下，检测需代谢活化产生遗传毒性的物质。33.(1)改进了3d肝细胞培养的步骤，由于3d细胞球体为一个结构紧密的聚集体，因此green pro taq hs预混型qpcr试剂盒(艾科瑞生物，中国)；引物(thermo公司，美国)；胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)(bi，美国)。44.hepg2细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。细胞保存于液氮，复苏后3?10代用于后续实验。45.cyto b储备液：称取定量cyto b溶于dmso中，超声至溶解。储备液浓度为5mg/ml，?20℃保存一个月，?80℃保存六个月。46.低渗液：称2.796g氯化钾于烧杯中，加入适量的去离子水，混匀至完全溶解，补充体积至500ml，混匀后将溶液转移至玻璃瓶中并做好标识，室温保存备用。47.固定液：以甲醇:冰醋酸＝3:1的比例配制所需体积，现用现配。48.giemsa应用液：临染色前将giemsa浓缩液用giemsa稀释液1:9稀释,配制giemsa应用液。49.主要仪器及耗材50.clm?170a?b二氧化碳恒温培养箱(esco公司，新加坡)；500?ⅱ?a/b3生物安全柜(上海瑞仰净化设备有限公司，中国)；cx21光学显微镜(奥林巴斯，日本)；细胞计数仪(chemometec a/s公司，丹麦)；st16r离心机(thermo fisher，美国)；imt?2?21倒置显微镜(奥林巴斯，日本)；移液器及配套枪头(eppendorf，德国)；超低吸附u形底96孔板(corning公司，美国)。51.测试化合物及化合物的信息及配制方法分别如表1和表2所示。52.表1测试化合物信息及配制方法[0053][0054]表2化合物信息及配制方法[0055][0056][0057]*:阳性对照[0058]灵敏度的判断是在本发明的试验体系中进行说明的。本发明的三个指标分别代表不同的遗传毒性机制，是单独进行评价的。三个指标中任何一个检出都代表可能的遗传毒性损伤。[0059]实施例1细胞培养及化合物处理[0060]cbmn?cyt的测定按照体外哺乳动物细胞微核试验(oecd tg487,2016)指南推荐的方法进行(fenech m.nature protocols,2007,2(5):1084?1104)。[0061]1.1 2d细胞培养及处理[0062]将处于对数生长期的hepg2细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液并以1×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，37℃±1℃、5±1％co2加湿培养。24h后吸去原培养基，加入配制好的含化合物及终浓度为5μg/ml cyto?b的培养液。每个处理组每种条件均平行处理2孔，加样体积为4ml。同时设含溶媒及终浓度为5μg/ml cyto?b的dmem培养基为对照组。阴性及阳性对照品给药制剂分别与细胞作用约48h(＞1.5个倍增周期)后弃去培养液。处理结束后，消化并制备成细胞悬液，收集每孔2d细胞悬液于15ml离心管，离心(1000rpm×5min)，弃去上清。[0063]1.2 3d细胞培养及处理[0064]将消化后的细胞悬液稀释到相应密度2.5×105/ml。预先在100mm细胞培养皿底加入10ml pbs缓冲液。使用多通道移液器,将上述细胞密度的细胞悬液以20μl/滴接种至倒置的100mm培养皿盖内侧，每个皿盖可接种50滴。轻轻翻转皿盖置于皿底，并将含有悬滴的皿转移至二氧化碳培养箱内，单层水平放置。培养3天后，悬滴内部会形成初始接种数为5000细胞/滴的细胞球体。第3天时，将悬滴内球体转移至超低吸附u形底96孔板中继续培养，隔天更换一半培养基，直至第7天。实验结果表明，初始接种数为5000细胞/滴的细胞球体，培养7天的细胞球体肝脏特异性指标及代谢酶基因表达量最高，为最佳的3d肝细胞模型培养条件。[0065]1.3白蛋白及尿素含量测定[0066](1)上清液的收集。选取2.5×105个·ml?1的细胞悬液作为初始细胞接种密度接种细胞球，按1.2的培养方式进行培养，并于特定天数(3、7、10、14天)收集细胞样品及上清液。2d细胞样本发明采用相同密度的细胞悬液接种于标准平底6孔板中，常规培养3天后收集细胞样品及上清液。每个细胞培养样品在取样前24h进行全换液(试剂会与牛血清中的白蛋白结合，应当使用无血清培养基处理24h)，24h后吸取上清液冻存于?20℃以备后续检测。[0067](2)消化与计数。将剩余的细胞球体(n＝12)收集于2ml的ep管中，待球体自然沉降至管底，加入1ml pbs冲洗两次，弃上清。随后加入500μl胰酶消化(37℃，3min)，随后涡旋使球体尽量裂解成小的团块，继续消化(37℃，3min)后加入1ml完全培养基终止消化，计数细胞总数用于估计各时间点的细胞数量。将6孔板中剩余上清液吸弃，将2d细胞消化、离心、重悬后制成细胞悬液并计数细胞总数用于估计细胞数量。[0068](3)尿素含量测定。按尿素检测试剂盒说明书进行尿素含量的检测。将放至常温的a液和b液以1:1混合制成工作液。将5μl的5mg·dl?1尿素标准品、去离子水和待测样品放入96孔板中，每孔加入200μl/孔工作液，室温孵育50min。使用ix6荧光酶标仪获取吸光度为430nm下的吸光度值。并按照如下计算公式进行计算，数据归一化至6×104个细胞。[0069]浓度计算公式：[0070][0071]od样品，od空白和od标准分别是样本、空白对照和标准品的吸光度，n是稀释系数。测低尿素样品时[std]＝5。[0072](4)白蛋白含量测定。按白蛋白检测试剂盒说明书进行白蛋白含量的检测。使用前，将试剂放置至室温并轻摇。用蒸馏水稀释不同浓度的标准品。取透明平底的96孔板，将15μl稀释的标准品(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mg·dl?1)及样本放入不同的孔中，每孔加入200μl试剂，孵育5min后使用ix6荧光酶标仪获取吸光度为620nm下的吸光度值。用标准品与空白对照的吸光度值制作标准曲线来确定样本的白蛋白浓度，数据归一化至6×104个细胞。[0073]1.4ⅰ相及ⅱ相代谢酶基因表达量测定[0074](1)样本的收集：将培养在t25培养瓶中的2d平铺生长的hepg2细胞及培养时间为3、7天的3d细胞球进行消化，并确定细胞数量(不超过1×107)。将细胞悬液转移到离心管中，并以1000rpm×5min离心后吸取上清液。通过轻弹管底彻底松解细胞沉淀，并添加mirneasy mini小型提取试剂盒中适当体积的buffer rlt裂解细胞。细胞裂解物可以在?70℃下储存数月。[0075](2)总rna的提取：将收集的冷冻裂解物样品在37℃下在水浴中温育直至完全解冻且盐溶解，使用mirneasy mini小型提取试剂盒分离得总rna，于冰上保存。[0076](3)使用evo m?mlv反转录试剂预混液及500ng total rna按比例配制成rt反应液，并转移至八连管中，反转录体系为10μl。反转录反应条件为37℃15min；85℃5sec；4℃。[0077](4)使用sybrpremix pro taq hs qpcr kit试剂与引物及上步反应制得的cdna产物按比例预混，在step one荧光定量pcr仪上反应，反应条件为：95℃30sec(1次循环)；95℃5sec，60℃30sec(40次循环)；建立pcr产物溶解曲线。[0078](5)使用7500fast real?time pcr系统(applied biosystems，美国)记录数据，每样本检测3个复孔。根据rt?pcr检测结果，以2d细胞样品的基因表达作为对照，采用δδct法计算出各待测物的待测基因相对于内参基因β?actin的相对表达量。[0079]1.5统计分析[0080]尿素、白蛋白、rt?pcr的结果均采用独立样本t检验的方法，以2d细胞模型组为对照组，将不同培养天数下3d细胞球体的值与对照组进行比较。[0081]表3ⅰ相及ⅱ相代谢酶基因引物序列[0082][0083]通过对3d肝细胞球体及常规培养细胞的显微镜观察结果显示(见图2)，2d和3d细胞经过3天连续培养后，呈现出不同的细胞形态。常规培养的hepg2细胞平铺生长，并具有明显的细胞形态。悬滴培养3天的hepg2细胞在重力的作用下，自聚集形成了一个质地紧密的细胞球体，细胞形态不明显。[0084]使用白蛋白产生及尿素水平为检测指标，比较不同培养方式的hepg2细胞的肝脏特异性功能的区别，数值被归一化为1×106个细胞的量，以消除样本间细胞数量不同所产生的差异。通过对3～14天上清液样本的测量，与2d细胞相比，3d培养的细胞上清白蛋白浓度显著升高，第7天为最高值(见图3)。同时，3d球体上清的尿素含量在第7天达到最高值(见图4)。由于培养时间为3天、7天的3d细胞球显示出了更好的细胞功能且培养时间较短，因此进一步选择3、7天的3d细胞球与2d细胞i、ii期代谢酶基因表达量对比，选择合适的3d细胞培养时间。[0085]hepg2细胞中低水平的药物代谢酶可能会导致需要代谢活化的物质无法检出。实时荧光定量pcr分析结果显示，3d hepg2球状体中不同i、ii期代谢酶的表达水平普遍高于2d培养的hepg2细胞(见图5)。7500fast real?time pcr系统分析球形体培养过程中i相代谢酶mrna的转录水平。培养天数为3天的3d hepg2细胞cyp1a1、ugt1a6基因表达显著性升高，cyp1a2、cyp3a4、cyp2e1、cyp2b6、ugt1a1与2d细胞无显著性差异。培养天数为7天的3d hepg2细胞的cyp1a1、cyp2c9、cyp2d6表达水平与2d细胞相比显著性升高，cyp1a2、cyp3a4、cyp2b6、cyp2e1表达水平与2d细胞一致。培养天数为7天的3d hepg2细胞的ii期异种生物代谢酶ugt1a6的mrna水平与2d细胞相比显著性增加，ugt1a1表达水平略高于2d细胞。[0086]将第7天时将含3d细胞球的ula96孔板从培养箱中取出，尽可能吸去原培养基，每孔加入不同浓度的阳性化合物及终浓度为5μg/ml cyto?b的培养液。每个处理组每种条件共平行处理12孔，加样体积均为100μl。同时设含溶媒及终浓度为5μg/ml cyto?b的dmem培养基为对照组。阴性及阳性对照品给药制剂分别与细胞作用约48小时后弃去培养液并收集各组6孔中的球体于15ml离心管，收集两管。用pbs清洗2次，弃上清。加入300μl胰酶消化6min，吹打至无明显细胞团块，加入1ml完全培养基终止消化，在ep管中加入1ml胰酶重悬细胞球体，置于37℃培养箱消化3min。此时细胞球体初步被消化，置于涡旋仪上涡旋，使完整的细胞球体裂解为较小的细胞团块。随后继续置于37℃培养箱继续消化3～5min，随后继续置于涡旋仪上涡旋或用移液枪吹打至无明显细胞团块。细胞球体已经完全消化成单细胞悬液进行后离心(1000rpm×5min)，弃去上清。如表4所示，实验结果表明，6～8min为3d细胞球体优选的消化时间，在上述时间内进行消化既能保证细胞球体可以充分消化为单细胞悬液，又能避免由于消化时间过长，导致细胞膜破裂影响后续制片过程，最终保证检测方法的准确性和有效性。化合物信息及配制方法见表2。[0087]表4消化时间对于细胞悬液制备的影响[0088][0089]1.3制片及染色[0090]低渗处理：离心后尽可能弃去上清并轻弹管身，用剩余少量培养基重悬细胞，确保细胞不会形成团块。缓慢加入1ml/支37℃预温的低渗液于重悬细胞，边加边震荡，置于室温低渗3～5分钟。[0091]固定：逐滴缓慢加入固定液3ml/支固定，固定结束后离心(1000rpm×5min)，弃上清液。每支离心管再逐滴加固定液约3ml/支随后离心(1000rpm×5min)，弃去上清液。滴片：离心管中留固定液约0.1～0.2ml，轻轻混匀，制成细胞悬液，以备滴片，载玻片必须严格清洗干净，一手持载玻片呈微倾斜装，另一手吸取少量混匀的细胞悬液，向载玻片一端滴2～4滴，使其自然往下均匀分散，然后于室温下干燥，制好的染色体玻片于室温或培养箱放置干燥，利于染色。将玻片完全晾干至少30分钟，可过夜。[0092]染色：滴片制备标本并编号。固定后的玻片标本浸入giemsa应用液中，染色25～30min；将染色后的标本用去离子水中冲洗干净，室温下自然干燥。[0093]如表5所示，3～5min为最佳的低渗时间。该低渗时间既可以保证细胞充分膨胀，又可以保证细胞不会低渗过度而破裂。[0094]表5低渗时间对染色玻片的影响[0095][0096]1.4镜检指标与统计分析[0097]镜检指标[0098]a.500个细胞中单核细胞，双核细胞及多核细胞数，计算胞质分裂阻滞增殖指数(cytokinesis?block proliferation index，cbpi)和复制指数(replicative index，ri)。cbpi表示在cyto?b暴露期间每个细胞的平均细胞周期数，并可用于计算细胞增殖。ri表示处理后培养物与对照培养物中细胞核的相对数量，可用于计算细胞生长抑制率(cytostasis)。[0099]cytostasis(％)＝100?100{(cbpit?1)/(cbpic?1)}[0100]cbpi＝(单核细胞数+2×双核细胞数+3×多核细胞数)/(总细胞数)[0101][0102]t＝处理组 c＝对照组[0103]b.每1000个双核细胞中mn、nbud和npb出现的千分率，并根据fenech方法评分(fenech m,et al.mutagenesis,2010,26(1):125?132)。[0104]统计分析[0105]使用spss.18，采用fisher精确检验方法，将化学处理组的mn‰，nbuds‰和npbs‰与溶媒对照组进行显著性比较(p≤0.05)。[0106]结果表明，(1)供试品所诱发的mn‰，nbud‰和npb‰显著增加，且有浓度依赖关系；[0107](2)某测试点所诱发的mn‰，nbud‰和npb‰显著增加，且可重复。[0108]符合上述中的一条即可判断为阳性，否则判断为阴性。统计学方法不是评价阳性结果的唯一标准，同时考虑生物学意义。[0109]结果如图1所示，2d模型组4个处理浓度下的mn‰、0.05、0.1μg/ml浓度组的nbud‰显著升高(p≤0.05)，具有剂量相关性，npb‰在0.025～0.1μg/ml有显著性差异，但没有剂量相关性(见表5)。3d肝细胞微核细胞组学各浓度的细胞生长抑制率(cytostasis)及ri与2d肝细胞模型组相当。3d肝细胞模型组4个mmc处理浓度下的mn‰与nbud‰均见显著升高(p≤0.05)，npb‰各浓度组均未见显著升高(见表6)。3d模型组mmc的mn‰及nbud‰最低检出浓度为0.0125μg/ml，而2d模型组最低检出浓度为0.025μg/ml。[0110]实验结果分别如表6和表7所示。[0111]表6 mmc的2d细胞微核细胞组学检测结果[0112][0113]*：p≤0.05。cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥；npb：核质桥[0114]表7 mmc的3d细胞微核细胞组学检测结果[0115][0116]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0117]本实施例表明经阳性化合物mmc处理后，2d及3d培养的hepg2细胞模型可于一定细胞毒性范围内检测到微核细胞组学指标显著升高。[0118]将2d肝细胞模型与3d肝细胞模型的mmc的cbmn?cyt检测结果进行对比。在细胞增殖抑制检测方面，2d肝细胞与3d肝细胞模型的细胞毒性指标100?ri与细胞生长抑制率都出现浓度相关性上升，提示mmc对2d肝细胞与3d肝细胞球体造成了相似程度的细胞损伤。在遗传毒性检测方面，3d模型组mmc的mn‰及nbud‰最低检出浓度为0.0125μg/ml，而2d模型组最低检出浓度为0.025μg/ml，npb阳性未在3d细胞模型该浓度范围内检出，在2d细胞模型中检出但不具有剂量相关性，且npb的值落在外周血淋巴细胞cbmn?cyt试验0～10‰的阴性参考范围内(fenech m,et al.mutagenesis,2010,26(1):125?132)。提示mmc可能在hepg2细胞中未通过诱导dna链断裂错误和端粒末端融合造成遗传毒性损伤。与已有hepg2及衍生细胞系的微核细胞组学研究的结果相似(diamond l,et al.carcinogenesis,1980,1(10):871?875，shah u k,et al.mutation res,2018,834(2018):35?41)。[0119]经阳性化合物mmc处理后，3d肝细胞模型可于一定细胞毒性范围内检测到微核细胞组学指标统计学意义的升高。本发明证明cbmn?cyt方法可成功地应用于hepg2肝球体，初步建立了3d肝细胞微核细胞组学方法。2d模型与3d模型的mmc微核细胞组学结果对比，3d肝细胞模型mn和nbud检测灵敏度高于2d肝细胞模型。接下来将进一步扩大3d肝细胞微核细胞组学的化合物检测范围，采用不同机制的遗传毒性化合物、可疑遗传毒性化合物及阴性化合物对该方法进一步验证。[0120]实施例2 3d肝细胞微核细胞组学试验方法的验证[0121]本发明按照体外哺乳动物细胞微核试验(oecd tg487,2016)指南的推荐选用了两种需代谢活化的遗传毒性化合物苯并芘(bap)和环磷酰胺(cpa)、一种非整倍体诱导剂秋水仙素(col)、两种可疑遗传毒性化合物(?)?表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和硫代乙酸糠酯和一种非遗传毒性化合物胺碘酮，对已建立的3d肝细胞微核细胞组学试验方法进行验证，探索该方法用于不同机制的化合物的适用性。[0122]本实施例挑选了6种代表性的不同遗传毒性机制的物质对体外3d肝细胞微核细胞组学方法进行了初步验证，并将实验结果与传统细胞培养方法下的微核细胞组学结果进行了对比。[0123]苯并芘(bap)是一种已知的间接诱变剂，在mn试验结果为阳性。bap作为一种前致癌物，属于多环芳烃类化合物，可被cyps(1a1和/或3a4)和微粒体环氧化物水解物依次激活产生遗传毒性。当hepg2细胞暴露于bap时，会产生不同的bap代谢物(bap?4,5?diol；bap?7,8?diol；bap?9,10?diol),一些醌类化合物和各种羟基代谢物；主要的dna加合物是由bap?7,8?diol?9.10?epoxide(bpde)反应产生的，是最终致癌的中间体(kirchner s,zeller a.mutation research/genetic toxicology and environmental mutagenesis,2010,702(2):193?198)。[0124]秋水仙素(col)是一种典型的非整倍体诱导剂，具有典型的非致癌致突变剂的特征。在体内和体外微核试验中阳性。它会引起由抑制微管蛋白聚合而引起的中期阻滞而致染色体数值畸变。在体外微核试验中，秋水仙碱都明确地在chl细胞和人类淋巴细胞、l5178y细胞中诱导微核增加(knasmüller s,et al.mutation research,1998,402(1?2):185)。[0125]环磷酰胺(cpa)须在体内代谢活化发挥细胞毒性作用。在体内，约70％～80％的cpa经由cyp2b6、cyp3a4、cyp3a5、cyp2c9、cyp2c19代谢生成中间产物，中间产物易通过非酶催化的消除反应生成磷酰胺氮芥和丙烯醛，进而产生遗传毒性(陈玲燕等.药学学报,2014,49(7):971?976.)。[0126](?)?表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)是绿茶提取物的主要成分，通过氧化应激反应在l5178y tk+/?小鼠淋巴细胞体外哺乳动物基因突变试验中出现阳性结果，体内微核研究结果为阴性(uehara t,et al.toxicology,2008,250(1):15?26)。本发明将egcg作为非体内遗传毒性，体外遗传毒性检测阳性的模型化合物，进一步评价体外3d肝细胞模型对可疑遗传毒性物质是否具有更好预测能力。实验结果显示，在2d细胞培养下，62.5～500μg/ml剂量组的mn出现阳性结果。已有报道表明，在体外培养条件下，egcg或儿茶素(egcg属于的化学物质家族)会产生h2o2，因此可在体外遗传毒性试验中呈阳性反应(johnson m k,loo g.mutat res,2000,459(3):211?218.)。[0127]硫代乙酸糠酯是一种常用的食品用香料。硫代乙酸糠酯在blue screen试验中发现具有细胞毒性(<80％的相对细胞密度)和遗传毒性；ames实验为阴性结果；体外人类外周血淋巴细胞微核试验100μg/ml(?s9,3h)和43μg/ml(?s9,24h)剂量组阳性；小鼠体内微核实验为阴性(api a m,et al.food and chemical toxicology,2020,144:111615.)。综合体内外试验数据，可以认为硫代乙酸糠酯是非遗传毒性化合物。[0128]胺碘酮是一种广泛使用的抗心律失常药物，用于治疗最常见的心律失常类型房颤，是一种非遗传毒性肝毒性药物(uehara t,et al.toxicology,2008,250(1):15?26.)[0129]2.1苯并芘的微核细胞组学检测[0130]苯并芘的微核细胞组学检测结果如表8和表9所示。[0131]与溶剂对照组相比，2d肝细胞模型组各处理浓度下的mn‰显著升高，10.09、20.19μg/ml浓度组nbud‰显著升高(p≤0.05)，且在该范围内，bap均未显示出明显的细胞毒性(见表8)。[0132]与溶剂对照组相比，3d细胞模型组均未显示出明显的细胞毒性，2.52、5.05、10.09、20.19μg/ml处理浓度下的mn‰及nbud‰显著升高(p≤0.05)，仅10.09μg/ml浓度组的npb‰显著升高，但未出现剂量相关性(见表9)。相同剂量下，3d细胞模型组的mn‰高于对应的2d细胞模型组，且3d细胞模型nbud‰这一指标灵敏度高于2d细胞模型组。[0133]表8 bap的2d细胞微核细胞组学检测结果[0134][0135]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0136]表9 bap的3d细胞微核细胞组学检测结果[0137][0138]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0139]2d和3d细胞模型均可通过mn这一指标检测出bap的遗传毒性。与2d细胞模型的实验结果相比，3d细胞模型实验的mn率总体高于2d细胞模型的mn率，且可在较低的浓度下检测出nbud的显著性升高，提供了bap遗传毒性相关信息。[0140]2.2秋水仙素的微核细胞组学检测[0141]秋水仙素的微核细胞组学检测结果如表10和表11所示。[0142]2d细胞模型组的ri及细胞生长抑制率显示col的细胞毒性随浓度增加而增强。与溶剂对照组相比，0.0025～0.01μg/ml处理浓度下2d细胞模型组的mn‰及nbud‰先升高，在高剂量0.02μg/ml组降低(见表10)。[0143]与溶剂对照组相比，3d细胞模型组0.0025～0.02μg/ml的mn‰、nbud‰、npb‰均有显著升高(p≤0.05)，并出现浓度依赖性的细胞毒性(见表11)。阳性对照组npb‰有显著性差异，但落在0～10‰的推荐阴性范围内(lorge e,et al.mutation research/genetic toxicology and environmental mutagenesis,2006,607(1):13?36)。与2d肝细胞模型组相比，3d肝细胞微核细胞组学方法在检测col方面具有更高的灵敏度，可在较大浓度范围内通过mn、nbud、npb检测到col的遗传毒性。[0144]表10 col的2d细胞微核细胞组学检测结果[0145][0146]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0147]表11 col的3d细胞微核细胞组学检测结果[0148][0149]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质[0150]在本实施例中2d结果显示与溶剂对照组比较，0.0025～0.01μg/ml浓度下的mn‰及nbud‰先升高而后在高剂量组0.02μg/ml降低。这可能是有丝分裂停止造成的细胞损失造成的。另外，由于col可诱导有丝分裂停止，与细胞急性死亡相比，ri等指数可能会过度反映这种强烈的细胞抑制活性(特别是在48h较长处理时间内)。因此，非整倍体诱导剂会在较高的毒性浓度范围内通过有丝分裂抑制微核的形成。[0151]在检测col时，不当的浓度间隔可能会降低对col的mn的敏感性，过大的浓度间隔可能错过最大反应浓度甚至较弱反应浓度，因此合适的浓度间隔对col的检测十分关键。3d肝细胞模型在col处理过程中，ri和细胞生长抑制率指标表明，肝细胞球体对col的细胞增殖抑制毒性具有一定的抵抗作用，并可在0.0025～0.02μg/ml范围内通过mn、nbud及npb检测到col的遗传毒性。[0152]2.3环磷酰胺的微核细胞组学检测[0153]环磷酰胺的微核细胞组学检测结果如表12和表13所示。[0154]2d细胞模型组的ri及细胞生长抑制率显示cpa的细胞毒性有浓度依赖性增加。与溶剂对照组相比，312.5～25000μg/ml处理浓度下的mn‰显著升高(p≤0.05)，312.5和2500μg/ml组nbud‰、npb‰显著性升高但未见明显浓度相关性(见表12)。[0155]将cpa组的微核相关指标与溶剂对照组比较，在312.5～2500μg/ml的剂量范围内mn‰显著升高；625～2500μg/ml的剂量范围内nbud‰显著升高，npb‰未见明显升高(见表13)。在nbud‰这一指标上，3d细胞模型与2d细胞模型相比较为敏感，且具有剂量相关性。[0156]表12 cpa的2d细胞微核细胞组学检测结果[0157][0158]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0159]表13 cpa的3d细胞微核细胞组学检测结果[0160][0161][0162]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0163]在本实施例中，312.5～2500μg/ml处理浓度下的mn‰显著升高(p≤0.05)。3d肝细胞组在312.5～2500μg/ml处理浓度下观察到mn‰显著升高(p≤0.05)。2d和3d hepg2细胞模型的微核诱导率较为相似，可能是因为诱导cpa代谢产生中间产物的cyp2b6与cyp3a4代谢酶基因并未在3d肝细胞模型中出现表达增强。3d肝细胞模型组625～2500μg/ml nbud‰显著性升高，且具有一定的剂量相关性，与2d模型相比较为敏感。[0164]2.4(?)?表没食子儿茶素没食子酸酯的微核细胞组学检测[0165](?)?表没食子儿茶素没食子酸酯的微核细胞组学检测结果如表14和表15所示。[0166]2d细胞模型组ri及细胞生长抑制率显示egcg在62.5～500μg/ml浓度范围内对2d肝细胞有明显的细胞毒性。与溶剂对照组相比，各浓度组的mn‰显著升高(p≤0.05)；250、500μg/ml剂量组nbud‰显著升高；npb‰各浓度组均未见显著性差异(见表14)。[0167]3d细胞模型组的ri及细胞生长抑制率显示egcg仅在500μg/ml剂量组对3d肝细胞有明显的细胞毒性，250、500μg/ml剂量组的mn‰、nbud‰显著升高，npb‰各浓度组均未见显著升高(见表15)。[0168]表14 egcg的2d细胞微核细胞组学检测结果[0169][0170]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0171]表15 egcg的3d细胞微核细胞组学检测结果[0172][0173]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0174]3d肝细胞微核细胞组学方法在62.5、125μg/ml的剂量范围内mn‰、nbud‰、npb‰各浓度组均未见显著升高。在250、500μg/ml剂量组出现细胞毒性及遗传毒性。在约20％的相同细胞毒性范围内，2d与3d细胞模型组均出现了遗传毒性。[0175]2.5硫代乙酸糠酯的微核细胞组学检测[0176]硫代乙酸糠酯的微核细胞组学检测结果如表16和表17所示。[0177]2d细胞模型组ri及细胞生长抑制率显示硫代乙酸糠酯在125～1000μg/ml浓度范围内对2d肝细胞无明显的细胞毒性，与溶剂对照组相比，各剂量组的mn‰、nbud‰、npb‰均未见显著性差异(见表16)。125～1000μg/ml硫代乙酸糠酯作用于3d肝细胞均未出现明显的细胞毒性和遗传毒性(见表17)。[0178]表16硫代乙酸糠酯的2d细胞微核细胞组学检测结果[0179][0180]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0181]表17硫代乙酸糠酯的3d细胞微核细胞组学检测结果[0182][0183]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率比；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0184]在本实施例中，在最高剂量1000μg/ml的剂量范围内，2d hepg2细胞模型和3dhepg2细胞模型均未检测出硫代乙酸糠酯的细胞毒性和遗传毒性。[0185]2.6胺碘酮的微核细胞组学检测[0186]胺碘酮的微核细胞组学检测结果如表18和表19所示。[0187]2d细胞模型组ri及细胞生长抑制率显示胺碘酮在最高剂量20.19μg/ml内作用于2d肝细胞有浓度相关的细胞毒性。与溶剂对照组相比，胺碘酮各剂量组的mn‰、nbud‰、npb‰均未见显著性差异(见表18)。与2d细胞模型相比，相同浓度下3d细胞模型组的细胞毒性较低。2d及3d细胞模型组均未检测出遗传毒性指标显著升高(见表19)。[0188]表18胺碘酮的2d细胞微核细胞组学检测结果[0189][0190]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0191]表19胺碘酮的3d细胞微核细胞组学检测结果[0192][0193][0194]*：p≤0.05；cbpi：胞质分裂阻滞指数；ri：复制指数；cytostasis：细胞生长抑制率；mn：微核；nbud：核芽；npb：核质桥[0195]在本实施例中，在51.6μg/ml剂量范围内，2d与3d细胞微核细胞组学细胞毒性指标ri、细胞生长抑制率都出现了浓度依赖性变化。不同于单层平铺生长的hepg2细胞的均匀暴露，肝细胞球体整体暴露于胺碘酮时，由于球体内外物质转运，内部细胞的暴露水平更低。此外3d细胞经过长期培养具备ecm的形成及整体细胞间物质信息交换功能，能更好的抵抗外界物质的毒性作用。本发明2d hepg2细胞模型和3d hepg2细胞模型均未检测出胺碘酮的遗传毒性。[0196]表20 2d及3d肝细胞微核细胞组学结果汇总[0197][0198]注：数字代表最低检出浓度(μg·ml?1)；n.t.：在本研究的浓度范围内未检测到，或无生物学意义。[0199]本发明使用不同机制的阳性化合物bap、col、cpa，可疑遗传毒性化合物egcg、硫代乙酸糠酯，非遗传毒性化合物胺碘酮对3d肝细胞微核细胞组学方法进行验证。成功检测出了bap、col、cpa为阳性化合物，硫代乙酸糠酯、胺碘酮为阴性化合物，egcg在高浓度组检测出了遗传毒性，检出浓度高于2d肝细胞微核细胞组学的结果。3d肝细胞模型提高了egcg体外微核细胞组学检测浓度的阈值。综合所有物质的检测结果，3d肝细胞微核细胞组学与常规微核细胞组学相比，nbud这一指标检测灵敏度可提高一倍。