用于癌症免疫疗法的MR1限制性T细胞受体52181

　　用于癌症免疫疗法的mr1限制性t细胞受体1.本发明涉及限于非多态性抗原呈递分子mr1的肿瘤反应性人t细胞抗原受体(tcr)的鉴别。从代表新型的人t细胞群(由发明人发现并称为mr1t的细胞)的克隆中分离功能性tcr转录序列，该人t细胞群在没有添加任何外来抗原的情况下并以mr1依赖性的方式与表达mr1的肿瘤细胞反应。本发明还涉及mr1限制性肿瘤反应性tcr基因序列在癌症治疗中的使用。背景技术：2.t淋巴细胞可以检测多种不同的由非多态性细胞表面分子呈递的非肽抗原，包括脂质和磷酸化类异戊二烯。这些t细胞的多样性表型和功能特性起到保护宿主免受感染、自身免疫和癌症的特殊作用。针对非肽抗原的t细胞库最近增加并包含粘膜相关的恒定t(mait)细胞，这些细胞对众多酵母和细菌产生的小核黄素前体作出反应，并由mhc i类相关蛋白mr1呈递。mait细胞在人血液、肾脏和肠道中很常见，并且包含大部分驻留在肝脏中的t细胞。活化后，mait细胞释放出一系列促炎和免疫调节细胞因子，并可介导直接杀伤被微生物感染的细胞。尚不清楚mr1除了将微生物代谢产物向mait细胞呈递之外是否还有其他作用。3.mr1为非多态性mhc i类蛋白，其在许多细胞类型的表面上以低水平表达。mr1在多个菌种中高度保守，人和小鼠mr1在蛋白质水平上具有>90％的序列同源性。4.发明人提出了存在可识别由mr1呈递的肿瘤相关抗原的人t细胞。这些新型t细胞可能参与肿瘤免疫监视，因此代表了癌症免疫疗法的新工具。用供体或源于患者的t细胞的过继性疗法(其设计成表达选定的肿瘤相关抗原的tcr)代表了在癌症患者中诱导临床相关的抗肿瘤免疫应答的一种有保证且安全的策略。然而，迄今为止已鉴别出的大多数肿瘤相关抗原是由多态性mhc分子呈递的肽。mhc基因的极端多态性限制了该方法在表达独特mhc等位基因的患者中的应用。靶向与非多态性抗原呈递分子(诸如mr1)结合的肿瘤抗原可以克服该限制，并且原则上适用于患有表达mr1的肿瘤的所有患者。使用识别mr1呈递的抗原的肿瘤反应性t细胞受体也可能具有补充由mhc呈递的肽抗原介导的抗肿瘤反应的优点，这排除了肿瘤抗原与相同类型的呈递分子结合所产生的交叉竞争。此外，该策略可提供在相同肿瘤细胞上靶向不同性质的抗原的可能性，从而最大限度地减少在选定性免疫压力下肿瘤逃逸变体的潜在发生。因此，鉴别mr1呈递的肿瘤相关抗原以及识别这些抗原的mr1限制性tcr的表征可能对癌症免疫疗法具有重要意义。5.基于本领域的上述状态，本发明的目的是提供治疗癌症的新型手段和方法。该目的通过独立权利要求的主题实现，并且通过本文公开的从属权利要求、示例和附图提供了进一步有利的解决方案。6.定义7.在本说明书的上下文中，术语mr1是指mr1基因(entrez 3140)或mr1基因产物(uniprot q95460)。8.mr1在非肿瘤患者的生理环境中呈递细菌核黄素副产物(以上称为“外源微生物衍生抗原”)并将其呈递给粘膜不变性t细胞。9.表达mr1的癌细胞在mr1上呈现特定的癌症抗原或许多特定的癌症抗原。10.在本说明书的上下文中，术语mr1t细胞是指表达能够与癌细胞呈递的mr1分子特异性结合的t细胞受体的t细胞。11.在本说明书的上下文中，术语mr1t细胞受体是指能够特异性结合由与mr1分子相关的癌细胞呈递的抗原的t细胞受体。12.本文所述的tcr序列或tcr分子包含完全有功能的tcrα和tcrβ多肽链，或tcrγ和tcrδ多肽链。如果提及具有特定序列的tcrα或β多肽，应理解为使其在本文所述的方法和细胞中完全有功能，需要存在互补的(分别为β或α)多肽链。同样，必要的修改也适用于γδ对。提及特定的tcrα、β、γ或δ序列意味着，它有可能与本文所述的原始克隆中与之配对的tcr序列配对，或与原始配对序列具有某些同一性的序列，如本文指定。提及特定的tcrα、β、γ或δ序列也意味着它可能与另一对配对的tcr序列配对。13.mr1呈递的癌症抗原的识别主要通过cdr3序列进行。其中本文提及仅以特定cdr3序列为特征的tcr序列，暗示该tcr序列是本文提供的完整α、β、γ或δtcr序列，并且所得的tcr分子与适当的第二序列配对。14.在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指单个定量参数，其表示通过逐个位置比较两个比对的序列而确定的序列比较结果。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的比对可以如以下进行：smith and waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法，needleman and wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的全局比对算法，pearson and lipman,proc.nat.acad.sci.85:2444(1988)的寻找相似性方法，或通过这些算法的计算机化实施，包括但不限于：clustal、gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。用于进行blast分析的软件是可公开获得的，例如通过国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。15.比较氨基酸序列的一个实例是使用默认设置的blastp算法：期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配项：0；矩阵：blosum62；空位罚分：存在11，扩展1；组成调整：条件组成评分矩阵调整。用于比较核酸序列的一个此类实例是使用默认设置的blastn算法：期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配项：0；匹配/不匹配评分：1.?2；空位罚分：线性。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性值是指使用blast程序套件altschul et al.,j.mol.biol.215:403?410(1990))使用上面确定的蛋白质和核酸比较默认参数获得的值。16.引用同一序列但未指定百分比值表示100％同一序列(即相同序列)。17.在本说明书中，术语阳性当在上下文中用于标记物表达时，是指通过荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中该荧光的中值荧光强度与用同型匹配的抗体染色后得到的荧光强度相比，至少高30％(≥30％)，特别是≥50％或≥80％，所述同型匹配的抗体不与相同的靶细胞特异性结合。这样的标记物表达由该标记物的名称后面的上标“加号”(+)表示，例如cd4+。18.在本说明书中，当在上下文中用于标记物表达时，术语阴性是指由荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中该荧光的中值荧光强度不高于用同型匹配的抗体染色后得到的荧光强度的130％，特别是不高于115％，所述同型匹配的抗体不与相同的靶细胞特异性结合。这样的标记物表达由标记物名称后面的上标减号(?)表示，例如cd127?。19.在本说明书的上下文中，术语核酸表达载体涉及质粒或病毒基因组，其用于以一定的方式转染(在质粒的情况下)或转导(在病毒基因组的情况下)带有某种目的基因的靶细胞。目的基因受启动子序列的控制，并且该启动子序列可在靶细胞内部操作，因此，目的基因可组成性或响应刺激转录，或取决于细胞的状态。在某些实施方案中，将病毒基因组包装到衣壳中以成为能够转导靶细胞的病毒载体。技术实现要素：20.在最广泛的意义上，本发明涉及治疗癌症的方法，其中从与表达mr1的癌细胞具有反应性的t细胞(mr1t细胞)中分离的tcr序列在基因转移入患者的t细胞群中后表达。这些外源性、转基因表达的tcr序列用于将对表达mr1的癌细胞特异性识别能力赋予t细胞，作为对患者肿瘤的治疗。21.本发明类似地提供了t细胞和t细胞制剂，所述t细胞制剂包含用mr1t细胞特异性tcr基因转导的多个t细胞。在某些实施方案中，用mr1t细胞tcr基因转导的t细胞可以与其他治疗干预组合用于过继性细胞免疫疗法。22.本发明还涉及根据我们先前建立的方案(de libero，同上)从相同的癌组织活检中制备肿瘤浸润性t细胞的方法。针对表达mr1蛋白的肿瘤细胞系测试各个t细胞克隆。研究了反应性最强的t细胞克隆的mr1限制性、肿瘤杀伤力和炎性细胞因子的释放。对所选t细胞克隆的tcr基因进行测序。具体实施方式23.反应性细胞对与表达mr1的癌细胞(以mr1限制性方式呈递癌抗原)的接触产生响应时，其会上调活化标记物(特别是前述段落中记载的标记物)，释放细胞因子并开始增殖。24.换句话说，显示mr1限制性活性的t细胞是可以由mr1显示的肿瘤相关的抗原激活的t细胞。25.这些细胞可以在对标记物具有特异性的经适当荧光标记的抗体染色后通过荧光激活细胞分选(facs)进行分选，或者通过用适当抗体标记的磁珠进行分选(这是临床环境中常用的分选方法)。26.本发明的第一方面涉及一种在不存在外源抗原时产生与mr1反应的转基因mr1t细胞制剂的方法。该方法首先涵盖确定哪些t细胞受体最可能对患者中特定的表达mr1的癌症具有反应性，然后从转移到细胞中的表达构建体制备表达这些特异性t细胞受体基因的t细胞群，以及将这些设计好的t细胞给患者施用。27.该方法包括以下步骤：28.a.提供从患者获得的肿瘤样品；29.b.将所述肿瘤样品与多个对mr1反应的mr1t细胞受体分子接触，并且30.?在多个t细胞克隆上呈递，其中每个t细胞克隆的特征在于具有与mr1反应的mr1t细胞受体分子；或31.?作为经过标记的可溶性mr1t细胞受体分子，以非细胞依赖性方式进行识别；32.c.识别对所述肿瘤样品特异性反应的多个t细胞克隆；33.d.提供t细胞制剂，特别是从同一患者获得的t细胞制剂；34.e.将一核酸表达构建体引入所述t细胞制剂从而产生转基因t细胞制剂，所述核酸构建体编码在所述t细胞克隆上表达的mr1反应性t细胞受体分子，其在步骤c中被识别出与所述肿瘤样品特异性反应。35.因此可以将患者的转基因t细胞制剂施用给患者。36.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于选自seq id no 065至seq id no 096中任一项的cdr3序列片段。同样，cdr3序列片段的特征在于与选自seq id no 065至seq id no 096中任一项的序列同一但具有一个或两个氨基酸取代的序列。在特定的实施方案中，据以下取代规则选择cdr3序列取代：37.?甘氨酸(g)和丙氨酸(a)可互换；缬氨酸(v)、亮氨酸(l)和异亮氨酸(i)可互换，a和v可互换；38.?色氨酸(w)和苯丙氨酸(f)可互换，酪氨酸(y)和f可互换；39.?丝氨酸(s)和苏氨酸(t)可互换；40.?天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)可互换41.?天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)可互换；n和s可互换；n和d可互换；e和q可互换；42.?蛋氨酸(m)和q可互换；43.?半胱氨酸(c)、a和s可互换；44.?脯氨酸(p)、g和a可互换；45.?精氨酸(r)和赖氨酸(k)可互换。46.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于选自seq id no 065至seq id no 096中任一项的cdr3序列，其中根据上述在三个n和/或c末端位置中的取代规则，该序列在三个n和/或c末端位置中包含总共最大0、1、或2个取代，而所示的cdr3序列的中心氨基酸没有改变。已知cdr3序列的中心部分对抗原结合或识别特异性贡献最大。47.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于选自seq id no 007至seq id no 012或seq id no 037至seq id no 060或seq id no 063至seq id no 064的核酸序列和/或选自seq id no 001至seq id 006或seq id no 013至seq id no 036或seq id no 061至seq id no 062的氨基酸序列。48.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于49.在本文中，“相同的生物学活性”是指重组tcr序列识别在癌细胞上呈递癌症抗原的mr1分子(或有助于识别)的能力。本文描述了确定这种相互作用的测定和方法。50.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于选自seq id no 007、009至011或seq id no 037至seq id no 048的t细胞受体α链核酸序列和/或选自seq id no 001、003至005或seq id no 013至seq id no 024的氨基酸序列。51.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可015和seq id no 027；或seq id no 016和seq id no 028；或seq id no 017和seq id no 029；或seq id no 018和seq id no 030；或seq id no 019和seq id no 031；或seq id no 20和seq id no 032；或seq id no 021和seq id no 033；或seq id no 022和seq id no 034；或seq id no 023和seq id no 035；或seq id no 024和seq id no 036；或从前两段给出的对中选择的一对其中每个配偶体可以与指示的seq id no具有至少85％(≥90％、95％、98％)同一性的序列并且该对具有与未突变对相同的生物学活性。59.在某些实施方案中，每个mr1特异性t细胞克隆或分离的、被标记的和多聚化的可溶性t细胞受体的特征在于t细胞受体γ链和δ链氨基酸序列选自seq id no 061和seq id no 062。60.在某些实施方案中，根据本发明的t细胞制剂从同一患者获得(自体过继性t细胞疗法)。该方法具有避免不良反应风险的优点，特别是由设计的t细胞制剂的内源性t细胞受体驱动的同种免疫反应。61.在某些实施方案中，根据本发明的t细胞制剂从另一个受试者获得，特别是与hla匹配的受试者(同种异体过继性t细胞疗法)。取决于hla匹配的质量，同种免疫的风险可能会很大，但与定制的患者个体疗法高得多的成本和监管障碍相比，大量选定预先制备的tc制剂的后勤和程序优势可能有助于该疗法在更大的患者群体中进行。62.将mr1t细胞受体表达构建体引入t细胞制剂中可以通过慢病毒转导实现，发明人在mr1t细胞的工作中经常使用慢病毒转导，或通过dna表达载体(质粒)或rna转染的标准方法实现。本领域技术人员知晓相关的方案和程序。63.任选地，转基因t细胞制剂可以在施用于患者之前保持培养一段时间以扩增其数量，并且再次任选地，进一步刺激其分化成特别期望的t细胞亚组。64.在某些实施方案中，从所述患者获得的t细胞制剂获自患者的外周血，特别是其中所述t细胞制剂通过选定外周血单核细胞(pbmc)以表达cd4、cd8、cd27、cd45ra和cd57中的一种或多种t细胞标记物而获得的。65.在某些实施方案中，从所述患者获得的t细胞制剂是从肿瘤活检中获得的，随后相继在体外扩增。在某些实施方案中，在植物凝集素、il?2、il?7和il?15的存在下，t细胞扩增。增殖t细胞通过磁分选分离并用于t细胞受体设计或用于克隆和分离肿瘤特异性mr1限制性t细胞。分离的mr1t细胞用于tcr基因克隆。66.多个mr1特异性t细胞克隆可以在上述程序之前制备，并且以库或组的形式保存，以便在需要快速表征出现肿瘤时进行临时使用。该步骤基本上是鉴别可识别特定肿瘤实体的mr1特异性t细胞受体分子。67.或者，可以产生可溶性mr1t tcr并使其多聚化(参见subbramanian et al.nature biotechnology,22,1429,(2004))。tcr多聚体将用荧光染料标记并用于染色从肿瘤活检分离的肿瘤细胞。可溶性mr1t tcr多聚体的结合将指示mr1t tcr识别肿瘤细胞的能力，因此将有助于选定适合该患者的基因疗法的mr1t tcr。68.本发明的另一方面涉及表达载体，其包含编码功能性t细胞受体异二聚体的核酸序列并使其转录，或能够与t细胞受体β链一起形成功能性t细胞受体异二聚体的t细胞受体α链，和/或能够与t细胞受体α链一起形成功能性t细胞受体异二聚体的t细胞受体β链。值得注意的是，发明人也发现了mr1特异性γ?δ异二聚体，因此上述限定同样适用于这些链。69.在表达载体包含编码t细胞受体α链或t细胞受体β链(或γ或δ链)的核酸序列的实施方案中，必须将两种不同的表达载体(一种编码α链(γ链)和一种编码β链(δ链))引入细胞中，以使所述细胞能够表达功能性t细胞受体异二聚体。t细胞受体异二聚体特异性结合mr1分子，其中所述mr1分子在肿瘤细胞上表达并呈递肿瘤相关抗原。70.上述核酸序列的表达由可在哺乳动物细胞，特别是人t细胞中运作的启动子序列控制。在某些实施方案中，启动子是组成型活化的启动子，例如通常用于分子生物学的cmv即刻早期启动子。在某些其他实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。71.在本发明该方面的某些实施方案中，表达载体中包含的核酸序列是或包含选自seq id no 007、seq id no 009或seq id no 011的核酸序列，和/或编码选自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005(α链)的氨基酸序列。72.在本发明该方面的某些实施方案中，表达载体中包含的核酸序列是或包含选自seq id no 008、seq id no 010或seq id no 012的核酸序列，和/或编码选自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006(β链)的氨基酸序列。73.本发明的另一方面涉及一种编码功能性t细胞受体异二聚体的核酸序列。t细胞受体异二聚体特异性地结合在呈递肿瘤相关抗原的肿瘤细胞上表达的非多态性mhc i相关(mr1)的抗原呈递分子。74.在某些实施方案中，核酸序列编码t细胞受体α链并且选自seq id no 007、seq id no 009或seq id no 011，或编码与选自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005的氨基酸序列对应的t细胞受体α链。75.在某些实施方案中，核酸序列编码t细胞受体β链并且选自seq id no 008、seq id no 010或seq id no 012或编码由选自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006的氨基酸序列指定的t细胞受体β链，或与选自seq id no 001至006的氨基酸序列至少具有85％(≥90％、95％、98％)同一性且具有相同生物学活性的序列。在特定实施方案中，每个氨基酸序列包含选自seq id 65、66、67、80、81和82的cdr3序列。76.在某些实施方案中，mr1 t细胞受体由本文公开的一条α链和一条β链构成。发明人出人意料地发现α和β链可以组合以产生能够识别mr1的功能性tcr分子。77.在某些实施方案中，mr1t细胞受体由一个α链和一个β链构成，与以下列表的序列所对应：78.a.seq id no 001和002，79.b.seq id no 003和004，80.c.seq id no 005和006，81.或选自以上给出的对的一对，其中每个配偶体可以与所指示的seq id no具有至少85％(≥90％、95％、98％)同一性的序列并且该对与未突变的对具有相同的生物学活性。在特定实施方案中，每个氨基酸序列均包含与指示的seq id no相同的cdr3序列，如可从下表推断出。82.本发明的另一方面涉及一种与非多态性mhc i相关的mr1抗原呈递分子结合的t细胞受体蛋白。mr1分子在肿瘤细胞上表达并呈递肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，通过根据本发明第一方面的方法鉴别结合非多态性mhc i相关mr1抗原呈递分子的t细胞受体蛋白。83.在某些实施方案中，t细胞受体蛋白包含t细胞受体α链，其特征在于选自seq id no 001、seq id no 003或seq id no 005的氨基酸序列，以及t细胞受体β链，其特征在于选自seq id no 002、seq id no 004或seq id no 006的氨基酸序列。84.本发明的另一方面涉及一种重组细胞，其包含如前述段落所述的根据本发明的表达载体和/或根据本发明的t细胞受体多肽。本领域技术人员知道，在表达载体仅包含编码t细胞受体α链或t细胞受体β链的核酸序列，而不是两者都包含的情况下，必须将两种不同的表达载体(一种编码α链，以及一种编码β链)引入重组细胞中，以便使所述细胞能够表达功能性t细胞受体异二聚体。在某些实施方案中，重组细胞源于外周血的t细胞。在某些实施方案中，重组细胞源于肿瘤浸润淋巴细胞。85.本发明的另一个方面涉及根据本发明前述方面的重组细胞在癌症冶疗或预防方法中的使用。该方法包括施用重组细胞。86.在某些实施方案中，所述癌症的特征在于表达mr1。87.在某些实施方案中，通过过继性t细胞免疫疗法实现该施用。88.本发明进一步涉及一种治疗或预防癌症复发的方法，包括施用根据本发明的重组细胞。在某些实施方案中，所述癌症的特征在于表达mr1。89.在某些实施方案中，通过过继性t细胞免疫疗法实现该施用。90.本发明还涉及核酸序列的集合，其中该集合的每个序列编码不同的t细胞受体α链、t细胞受体β链、t细胞受体γ链、t细胞受体δ链或t细胞受体α链和β链的组合，或t细胞受体γ链和δ链的组合，其中所述组合能够特异性结合呈递癌症抗原的mr1分子。核酸序列能够促进哺乳动物细胞中t细胞受体α链、β链或α和β链组合的表达。91.该集合将用于选定转基因构建体，以转移到从患者收集的t细胞中。在鉴别出最适合在该治疗方法的第一阶段对肿瘤所呈递的一组特定肿瘤抗原发起反应的tcr序列后，医生将需要能够从根据gmp制造的该集合中选定预先产生的表达载体，以快速实现基因转移到患者的t细胞中。92.在某些实施方案中，该集合包含选自seq id no 007至seq id no 012的序列，和/或该集合包含编码选自seq id no 001至seq id no 006的t细胞受体分子(或构成α或β的t细胞受体)的序列。93.本发明的另一个方面涉及一种重组t细胞集合，其中该集合的每个细胞表达能够与呈递癌抗原的mr1分子特异性结合的t细胞受体作为转基因体。在某些实施方案中，该集合包含这样一种重组t细胞，该重组t细胞包含根据本发明各方面的t细胞受体蛋白异二聚体。94.发明人鉴别并分离了一种新型人mr1限制性t细胞群体，该群体以mr1依赖性方式对多种肿瘤细胞产生反应。mr1t细胞克隆通常在不同健康个体的血液中发现，表达不同的tcr基因，并且不识别先前鉴别的mr1微生物或叶酸衍生配体。相反，他们认识到从肿瘤细胞中分离并由mr1呈递的各种不同组的未知抗原。目前正在进行与肿瘤细胞相关的刺激性抗原的鉴别和表征。mr1t细胞克隆识别并杀伤不同类型的肿瘤细胞，因此在体外显示出标记的抗肿瘤活性。此外，他们释放th1、th2和th17细胞因子的不同组合，并显示多种趋化因子受体表达谱、表明表型和功能多样性。重要的是，当从各个的mr1t细胞克隆分离的配对的tcrα和β基因或tcrγ和δ基因转移到tcr缺陷的t细胞中时，受体t细胞获得识别表达mr1的肿瘤细胞的能力，从而表明mr1t细胞tcr基因转移对于该类型的肿瘤识别是足够的，并且可以用于指示选定的t细胞识别表达mr1的肿瘤细胞。95.总之，这些发现揭示了一种新型功能多样的肿瘤反应性人t细胞群，其限于非多态性mr1分子，在肿瘤免疫中具有不同的潜在作用，从而为癌症免疫监测和免疫疗法提供新的概念框架。96.在本说明书中，使用以下缩写：apc：抗原呈递细胞；β2m：β2微球蛋白；dc：树突状细胞；gm?csf：粒细胞?巨噬细胞菌落刺激因子；hplc：高压液相色谱法；ifn?γ：干扰素?γ；mab：单克隆抗体；mait细胞：粘膜相关的不变t细胞；mhc：主要组织相容性复合体；mr1：mhc i类相关分子；mr1t细胞：mr1限制性t细胞；pbmc：外周血单核细胞；tcr：t细胞受体；til：肿瘤浸润淋巴细胞。97.通过以下示例和附图进一步说明本发明，从中可以得出进一步的实施方案和优点。这些示例旨在说明本发明，但不限制其范围。附图说明98.图1.mr1t细胞不识别微生物抗原。(a)ccrfsb、thp?1和a375?mr1细胞对mr1的表面表达。灰色直方图表示用同型匹配的对照mab染色。在不存在(无ag)或存在大肠杆菌裂解物(大肠杆菌)和/或抗mr1阻断mab(α?mr1)的情况下，由三种细胞系在a中刺激(b)mr1t细胞克隆dgb129或(c)mait细胞克隆smc3。mait克隆smc3先前从健康供体的pbmc中分离并表达经典的mait表型和功能。柱表示ifn?γ释放(平均值±sd)。thp?1细胞刺激(d)dgb129 mr1t或(e)smc3 mait细胞，结构上表达表面mr1，载有合成的6,7?二甲基?8?d?核糖基嗪(rl?6，7?二聚体)以及具有或不具有抗mr1 mab。柱表示平均ifn?γ释放+sd。数据代表四个(a、b和c)，两个(d和e)。*p<0.05(非配对student t检验)。99.图2.从外周t细胞中分离mr1t细胞克隆的策略。(a)在不存在外源抗原的情况下与a375?mr1细胞过夜共培养后，用经照射的a375?mr1细胞预先扩增的纯化t细胞的facs分析。左点图显示活细胞中的cd3和细胞追踪紫色(ctv)染色。右点图显示cd3阳性ctv阴性门控细胞的cd69和cd137表达。箭头表示门控层次结构。数字表示门内细胞的百分比。来自供体a的细胞示出为代表性供体。(b，d)从供体a和b筛选的t细胞克隆的累积结果。如a中所示，从cd3+ctv?cd137+分选的t细胞产生t细胞克隆。图表显示各个克隆(x轴)及其ifn?γ释放(y轴)，表示为响应于a375?mr1细胞对a375 wt细胞分泌的细胞因子的量之间的比率。每个点代表单个t细胞克隆，在指定的实验条件下同时测试。垂直线表示显示mr1限制性反应性的t细胞克隆的数量(即显示ifn?γ释放率高于任意截止值2的克隆)。结果代表两个独立实验。(c，e)在阻断抗mr1 mab(α?mr1)存在下用a375 wt、a375?mr1和a375?mr1刺激后，供体a和来自供体b的11个克隆的14个代表性克隆释放ifn?γ。点代表每个克隆的ifn?γ释放(重复培养物的平均值±sd)。结果代表三个独立实验。*p<0.05(非配对student t检验)。100.图3.mr1t细胞在健康个体的血液中是常见的。(a)在与a375 wt或a375?mr1细胞过夜共培养后，来自代表性供体(供体c)的纯化t细胞的流式血细胞术分析。点图显示活cd3+细胞上的cd69和cd137表达。数字表示门中细胞的百分比。(b)与a375 wt或a375?mr1细胞过夜共培养后来自5个不同供体的cd69+cd137+t细胞的频率。(c)来自供体c的t细胞克隆刺激测定的累积结果。从cd3+cd69+cd137+分选的t细胞产生t细胞克隆，如右点图所示。该图显示了测试克隆的数量(x轴)和ifn?γ释放(y轴)，表示为响应于a375?mr1细胞对a375 wt细胞分泌的细胞因子的量之间的比率。每个点代表单个t细胞克隆，在指定的实验条件下同时测试。垂直线表示显示mr1限制性反应性的t细胞克隆的数量(即显示ifn?γ释放率高于任意截止值2的克隆)。结果代表两个独立实验。(d)来自供体c的8个代表性mr1限制性t细胞克隆在没有外源抗原的情况下识别a375?mr1但不识别a375 wt细胞。通过阻断抗mr1 mab(α?mr1)抑制t细胞克隆对a375?mr1细胞的反应性。点代表在三个实验条件下测试的每个克隆的ifn?γ释放(重复培养物的平均值±sd)。结果代表三个独立实验。*p<0.05(非配对student t检验)。101.图4.mr1t tcr基因转移赋予a375细胞mr1限制性识别。分别在大肠杆菌裂解物和抗mr1 mab存在或不存在的情况下，通过表达(a375?mr1)或缺少(a375 wt)mr1的a375细胞刺激(a)表达dgb129 tcr(skw3?dgb129)的skw?3细胞和(b)表达mait mrc25 tcr(j.rt3?mait)的j.rt3?t3.5细胞。在存在或不存在抗mr1 mab的情况下，用a375?mr1或a375 wt细胞通过三种单独mr1t细胞克隆(c)dga4(skw3?dga4)、(d)dgb70(skw3?dgb70)和(e)jma(skw3?jma)刺激表达tcr的skw?3细胞。示出了转导的t细胞的重复培养物的cd69中值荧光强度(mfi)+sd。还示出了在不存在apc的情况下培养的转导t细胞的cd69 mfi。当与a375?mr1或a375 wt孵育时，模拟转导的t细胞示出了cd69表达的背景水平(未示出)。数据代表三次独立的实验。*p<0.05(非配对student t检验)。102.图5.mr1t细胞克隆对各种类型肿瘤细胞的鉴别识别。(a)在没有(无ag)或存在大肠杆菌裂解物(大肠杆菌)的情况下，通过代表性smc3 mait细胞克隆识别表达mr1组成型表面水平的四种人细胞系，该裂解物具有或不具有抗mr1阻断mab(α?mr1)。(b)通过具有或不具有抗mr1 mab(α?mr1)的13个mr1t细胞克隆识别与a中相同的细胞类型。图表显示ifn?γ释放(重复培养物的平均值±sd)。103.图6.mr1t细胞克隆不与微生物配体或6?fp反应。(a)在存在或不存在大肠杆菌裂解物的情况下，7个mr1t细胞克隆和一个对照mait细胞克隆与表达(a375?mr1)或不表达a375细胞(a375 wt)mr1共培养的反应。还示出了由抗?mr1 mab(α?mr1)阻断t细胞克隆反应性。(b)在6?甲酰蝶呤(6?fp)存在下，mr1t细胞克隆对表达wt mr1分子(a375?mr1)或k43a突变的mr1分子(a375?mr1 k43a)的a375细胞的响应。(c)用a375?mr1或a375?mr1 k43a细胞刺激对照mait细胞克隆mrc25或对照tcr vγ9vδ2克隆g2b9，该细胞预先分别在没有或存在6?fp的情况下与大肠杆菌裂解物或唑来膦酸盐一起孵育。结果表示为在重复培养物中测量的ifn?γ的平均值±sd。结果代表三个独立实验。*p<0.05(非配对student t检验)。104.图7.mr1t细胞克隆不识别ac?6?fp。(a)在不存在或存在乙酰基?6?甲酰基蝶呤(ac?6?fp)的情况下通过a375?mr1细胞刺激三个代表性mr1t细胞克隆。(b)在不存在或存在ac?6?fp的情况下，用大肠杆菌裂解物脉冲的a375?mr1细胞刺激两个mait细胞克隆(mrc25和smc3)。(c)在不存在或存在ac?6?fp(25μg/ml)的情况下，用唑来膦酸盐(zol)处理a375?mr1细胞，并用于刺激tcrvγ9?vδ2细胞克隆(g2b9)。(d)在不存在或存在ac?6?fp(25μg/ml)的情况下，使用表达k43a突变体mr1分子(a375?mr1k43a)的a375细胞刺激a中示出的三个mr1t细胞克隆。(e)在不存在或存在ac?6?fp(25μg/ml)的情况下，用大肠杆菌裂解物脉冲的a375?mr1 k43a细胞刺激b中使用的两个mait细胞克隆。结果表示为在重复培养物中评估的ifn?γ释放的平均值±sd，并且代表三个独立实验。*p<0.05(非配对student t检验)。105.图8.mr1t细胞识别肿瘤细胞中存在的抗原，而不是源自rpmi 1640培养基。通过mr1过表达(a)a375细胞(a375?mr1)和(b)thp?1细胞(thp1?mr1)在rpmi 1640或pbs中生长4天刺激dgb129 mr1t细胞克隆，两者都补充有5％的人血清。示出了抗mr1阻断mab(α?mr1)对t细胞克隆反应性的抑制。dgb129细胞识别载有分离自(c)thp?1细胞裂解物或来自(d)体内生长的小鼠乳腺肿瘤emt6的apc分离物。分离物e1和e2含有疏水分子；分离物n1至n4含有亲水分子。(e)dgb70 mr1t细胞与thp?1裂解物的n3分离物反应。(f)通过加载到塑料结合的重组mr1上的thp?1衍生的分离物n3和n4刺激dgb129和dgb70t细胞。示出了重复培养物的ifn?γ或gm?csf平均值±sd的t细胞释放(代表三次独立实验)。总细胞因子释放在组a、组b、组f中示出；在组c、组d、组e中示出了背景上的折叠增加。*p<0.05(非配对student t检验)。106.图9.mr1t细胞显示出不同的抗肿瘤反应。表达mr1的肿瘤细胞系thp?1和a375与mr1t细胞克隆(a)dgb129或(b)dgb70以指定的效应物：靶向(e：t)比率培养过夜。该图示出了在各个实验条件下凋亡靶细胞的百分比，通过使用膜联蛋白v和碘化丙锭染色的流式细胞术评估。通过用抗cd3 mab染色鉴别mr1t细胞并从分析中排除。抗mr1(α?mr1)mab对mr1t细胞克隆杀伤能力的抑制也以1：1e：t比例示出。(c)通过具有或不具有抗mr1mab(α?mr1)的13个mr1t细胞克隆从健康个体分离的mo?dc的识别。图表显示ifn?γ释放(重复培养物的平均值±sd)。(d)在不存在或存在抗mr1(α?mr1)mab的情况下，由代表性dgb129 mr1t细胞克隆识别来自三个供体的mo?dc。示出上清液中的ifn?γ释放并表示为平均值±sd。(e)与具有或不具有抗mr1 mab(α?mr1)的dgb129 mr1t细胞共培养后，mo?dc上的共刺激分子cd83和cd86的流式细胞术分析。还示出了在不存在t细胞的情况下用lps(10ng/ml)刺激的mo?dc组成的对照组。数字表示每个象限中细胞的百分比。(f)在存在或不存在抗mr1 mab(α?mr1)的情况下通过ls 174t和hct116胃肠道肿瘤细胞系和正常肠上皮细胞(gec)刺激jman mr1t细胞克隆。柱显示ifn?γ释放(重复培养物的平均值±sd)。所有结果均代表至少三次独立实验。*p<0.05(未配对学生的t?检验)。107.图10.mr1t细胞克隆的功能多样性。(a)由用a375?mr1细胞刺激的7个选定的mr1t细胞克隆释放的ifn?γ。elisa结果表示为在重复培养物中测量的ifn?γ释放的平均值±sd。(b)通过对相同上清液进行多重细胞因子测定分析附加的16种细胞因子，其中ifn?γ显示在a中。结果代表两个独立实验。108.图11.mr1t细胞克隆显示多种趋化因子受体表达谱。通过七个选定的静息mr1t细胞克隆对cxcr3、ccr4和ccr6表面表达进行流式细胞术分析。图表示出了通过将特定mab染色的中值荧光强度(mfi)除以相应同型对照的mfi而计算的相对荧光强度。数据代表两个独立实验。109.图12.mr1t细胞减少小鼠中人黑素瘤肺结节的数量。向免疫失能的nsg小鼠注射表达mr1(a375?mr1)和mr1t细胞的人黑素瘤a375细胞。在第14天，处死小鼠并在印度墨水灌注后计数肺结节。110.p<0.0001(非配对student t检验)。111.示例112.方法113.细胞。以下人细胞系获自美国典型培养物保藏中心：a375(黑色素瘤)、thp?1(髓单核细胞白血病)、j.rt3?t3.5(tcrβ缺陷型t细胞白血病)、ls174t(结肠腺癌)、hct116(结肠癌)、huh7(肝细胞癌)、hek 293(人胚肾)和ccrf?sb(急性b细胞淋巴母细胞白血病)。skw?3细胞(tcrα、β、γ和δ基因缺陷的人t细胞白血病)获自莱布尼茨研究所dsmz?德国微生物和细胞培养物保藏中心。两个代表性的mait克隆(mrc25和smc3)和一个tcrγδ克隆(g2b9)((gober et al.,the journal of experimental medicine 197,163?168(2003))在该研究中用作对照细胞，从两个健康供体的血液中产生，并如前所述保持在培养物中(lepore et al.,nat commun 5,3866(2014))。mr1t细胞从健康个体的外周血中分离出来，在采集血液时获得献血者的知情同意，并获得“北西伦理委员会和zentraschweiz/eknz(139/13)”的批准。简而言之，通过阴性选定纯化的t细胞(easyseptm人t细胞富集试剂盒，stemcell)每周用辐射(80灰度)a375?mr1细胞(比例2:1)刺激一次，持续三周。人ril?2(5u/ml；hoffmann?la roche)，ril?7和ril?15(均为5ng/ml，peprotech)在每次刺激后第+2和+5天加入。最后一次刺激后12天，洗涤细胞并与a375?mr1细胞共培养过夜(比例2：1)。然后cd3+cd69+cd37+细胞在pha(1μg/ml，wellcome research laboratories)、人ril?2(100u/ml，hoffmann?la roche)和辐射pbmc(5x105细胞/ml)存在下通过限制稀释进行分选和克隆。在其他实验中，使用与分选的cd3+cd69+cd137+相同的方案，在用a375?mr1细胞(比例2：1)进行单次过夜刺激时，产生mr1t细胞克隆。按照相同的方案周期性地再刺激t细胞克隆(lepore等人，同上)。根据制造商的说明书，使用easysep人cd14和cd19阳性选定试剂盒(stemcell technologies)从健康供体的pbmc纯化单核细胞和b细胞(>90％纯度)。如前所述(lepore等人，同上)，通过在gm?csf和il?4存在下培养，使mo?dc与纯化的cd14+单核细胞分化。根据公开的方案(graves等人，journal of immunological methods 414,20?31(2014))从无肿瘤个体的肠活组织检查分离人正常肠上皮细胞(gec)。114.表达与β2m共价联接的mr1a基因的细胞的产生。如前所述(lepore et al.，同上)，通过pcr产生经由柔性gly?ser接头与β2m联接的人mr1a cdna构建体。使用以下引物将mr1a cdna中的k43a取代引入融合构建体：mr1k43a_f5'?ctcggcaggccgagccacgggc(seq id no 097)和mr1k43a_r 5'gcccgtggctcggcctgccgag(seq id no 098)。将得到的wt和突变体构建体克隆到双向慢病毒载体(lv)中(lepore等人，同上)。根据制造商的说明书，使用metafectene pro(biontex)，用单独的lv?mr1a?β2m构建体与慢病毒包装质粒pmd2.g、pmdlg/prre和prsv?rev(addgene)一起转染hek 293细胞。在8μg/ml硫酸鱼精蛋白存在下，通过含有病毒颗粒的上清液的自旋感染转导a375和thp?1细胞。通过流式细胞术评估mr1的表面表达，并对阳性细胞进行facs分选。115.可溶性重组β2m?mr1?fc融合蛋白。使用上述人mr1a?β2m构建体作为模板获得β2m?mr1?fc融合构建体。使用引物：β2mxhoi_f5'?ctcgagatgtctcgctccgtggcctta(seq id no 099)和mr1?igg1_r5'?gtgtgagttttgtcgctagcctgggggacctg(seq id no 100)，通过pcr扩增与β2m?mr1a基因互补的dna，从而排除mr1跨膜和细胞内结构域。使用以下引物产生与人igg1重链的铰链区和ch2?ch3结构域互补的dna：nhei?hinge?f5'?caggtcccccaggctagcgacaaaactcacac(seq id no 101)和igg1noti_r5'?gcggccgctcatttacccggagacagggaga(seq id no 102)pfuse?higg1?fc1(invivogen)。使用具有重叠延伸pcr的两步剪接将β2m?mr1a和igg1 pcr产物连接在一起，并将得到的构建体亚克隆到bcmgsneo表达载体的xhoi/noti位点中。使用metafectene pro(biontex)用最终构建体转染cho?k1细胞，通过有限稀释克隆并通过elisa筛选以产生β2m?mr1?fc融合蛋白。适用于ex?cell acf cho无血清培养基res 3,236?244(2015))。将新切除的肿瘤在盐水中充分洗涤、称重，并使用dounce组织研磨机将4g质量在7ml hplc级水中匀浆。肿瘤匀浆经历两次冻?融循环，在4℃下离心(3,250g)10分钟，收集上清液并储存在?70℃。用2ml hplc级水第二次提取沉淀，在4℃下离心(5,100g)10分钟，收集上清液并储存在?70℃下。在室温下通过涡旋将该沉淀物用9ml hplc级甲醇进一步提取5分钟，在4℃下离心(5,100g)10分钟，并收集上清液。合并三个上清液，干燥并重新混悬于水：甲醇(10：1)中。如上所述使用c18和nh2 sep?pak柱分离物质。121.t细胞活化测定。mr1限制性t细胞(5×104/孔，除非另有指明)与指定的靶细胞(5×104/孔)在200μl总体积中一式两份或一式三份进行共培养。将t细胞与指定的apc一起培养24小时。在一些实验中，加入抗mr1 mab(克隆26.5)或小鼠igg2a同型对照mab(均为30μg/ml)并在加入t细胞之前孵化30分钟。从在lb培养基中生长的dh5α菌株(invitrogen)制备大肠杆菌裂解物，并在指数级生长期间收集。将细菌细胞在pbs中洗涤两次，然后通过超声处理裂解。离心(15,000g持续15分钟)后，收集上清液、干燥，并在?70℃下储存。在加入t细胞之前，用相当于108cfu/ml(除非另有说明)的大肠杆菌裂解物将apc脉冲4小时。在一些实验中，在与t细胞共培养之前，将apc与6?fp或ac?6?fp(schircks laboratories))预孵育4小时。在用表达tcrvγ9和vδ2链的tcrγδ细胞的对照实验中，在加入t细胞之前，首先用唑来膦酸盐(10μg/ml)处理apc 6小时。通过将β2m?mr1?fc包被在96孔板(4μg/ml)上并在37℃下用柱纯化的细胞裂解物加载4小时，用板结合的重组人β2m?mr1?fc进行活化实验，然后洗涤两次并添加t细胞。24小时后收集上清液，并通过elisa评估ifn?γ或gm?csf。根据制造商的说明书，细胞培养上清液中的多种细胞因子和趋化因子使用milliplex map人细胞因子/趋化因子磁珠板?预混合41plex(hcytmag?60k?px41；merck millipore)。在flexmap 3d系统(merck millipore)上获得样品，并使用milliplex分析软件确定平均荧光强度和分析物浓度。122.杀伤肿瘤细胞。在存在或不存在抗mr1 mab(30μg/ml，克隆26.5)的情况下，使用靶细胞系(2×104细胞/ml)进行杀伤测定，该靶细胞系单独或与不同e/t比例的t细胞孵育24小时。如前所述，靶细胞用pe?膜联蛋白v(bd)和碘化丙啶(pi)(sigma?aldrich)染色(2)。通过用抗cd3 mab染色鉴别t细胞并从分析中排除。细胞凋亡评估如下：膜联蛋白v+pi+＝晚期凋亡和膜联蛋白v?pi+＝坏死。还示出了在不存在t细胞的情况下(自发凋亡；没有t细胞)凋亡+坏死细胞的百分比。123.统计值。使用非配对student t检验(prism 6，graphpad软件)分析数据。124.鉴别和表征健康供体中新型肿瘤反应性mr1限制性t细胞125.发明人检测了在人mait细胞库的早期研究期间不与微生物配体反应的非典型mr1限制性t细胞克隆。该t细胞克隆(dgb129)识别组成型显示表面mr1的细胞系(ccrf?sb淋巴细胞白血病细胞，或thp?1单核细胞白血病细胞；图1a)或用mr1基因转染(a375黑素瘤细胞；a375?mr1；图1a)，在没有任何外源添加的抗原的情况下(图1b)。mr1+靶细胞的无菌识别通过用抗mr1单克隆抗体(mab)阻断而受到完全抑制(图1b)，因此类似于平行评估的mait细胞对大肠杆菌衍生抗原的反应(图1c)。重要的是，dgb129t细胞也未能识别合成的mait细胞激动剂6,7?二甲基?8?d?核糖基嗪(rl?6,7?dime；图1d)与对照mait细胞克隆不同，该克隆通过该化合物以mr1依赖性方式刺激(图1e)。dgb129细胞不表达典型的mait细胞的经典型半不变tcr(表1)。126.发明人研究了dgb129克隆是否代表不同于微生物反应性mait细胞的新型肿瘤反应性mr1限制性t细胞群。因此，他们建立了一种分离和研究这些不可预测的mr1限制性t细胞的方法。来自两个健康供体的纯化t细胞用增殖标记物celltrace紫色(ctv)标记，并在不存在外源抗原的情况下用经照射的a375?mr1细胞刺激。用a375?mr1细胞再次攻击增殖细胞，并通过有限稀释分选和克隆表达高水平活化标记cd137的那些细胞(图2a)。然后研究各个t细胞克隆识别缺少mr1的a375?mr1和a375细胞(a375?wt)的能力。在两个供体中，发明人发现大部分的t细胞克隆(分别为126/195和37/57)显示a375?mr1细胞的特异性识别(图2b、图d)，其被抗mr1阻断mab抑制(图2c、图e)。用12个mr1反应性t细胞克隆的tcr vβ特异性mab染色显示它们表达7种不同的trbv链(trbv4?3、6?5/6?6/6?9、9、18、25?1、28、29?1)其中一些克隆共享相同的trbv基因。此外，没有一个表达trav1?2链，对mait细胞来说是经典的。127.缺乏特异性标记物使得难以通过标准流式细胞术在体外单独鉴别这些新型t细胞。因此，通过在非常短时间的体外刺激和单个t细胞克隆实验之后组合流式细胞术分析来估计其频率。将来自五个健康供体的纯化的血液t细胞与mr1缺陷的或mr1足够的a375细胞共培养过夜，并分析活化标记物cd69和cd137的表达(图3a)。在筛选的所有五个供体中，用a375?mr1细胞(范围为t细胞的0.034?0.072％)刺激后检测到的cd69+cd137+t细胞百分比始终高于与a375?wt细胞共培养后的百分比(范围为0.015?0.032％)(图3a、图b)。由于两种类型的apc对mr1表达不同，mr1反应性t细胞在用mr1阳性apc刺激后导致活化的t细胞数量增加。使用该方法，发明人估计所分析的个体的循环t细胞库含有a375?mr1反应性t细胞，频率范围在1：2500(0.072?0.032＝0.04％)和1：5000(0.034?0.015＝0.019)之间。该估计频率高于抗原暴露后肽特异性cd4+t细胞的频率(lucas et al.,j virol 78:7284?7287；su et al.,immunity 38:373?383)。这些观察结果得到平行实验的支持，其中克隆了来自这些供体之一(供体c，图3a，右图)的分选的cd69+cd137+过夜活化的t细胞。实际上，96个筛选的t细胞克隆中的31个(32％)显示出对a375?mr1细胞的特异性反应性(图3c)，其被抗mr1 mab抑制(图3d)。因此，该供体的血液t细胞中计算出的a375?mr1反应性t细胞的频率为1：5000(0.065×0.32＝0.02％)，该值与估计范围一致。对来自三个供体的代表性t细胞克隆的详细分析证实其显示出不同的tcrα和β链，并且表明cd4、cd8和cd161的差异表达(表1)。128.总的来说，这些发现表明，所鉴别的肿瘤反应性mr1限制性t细胞是健康人个体(下文称为mr1t细胞)血液中新的但常见的淋巴细胞多克隆群。129.mr1t细胞tcr基因转移赋予mr1限制的肿瘤细胞识别130.发明人接下来研究了mr1t细胞对肿瘤细胞的反应性是否由tcr介导。在tcr缺陷的skw?3细胞中克隆来自不同mr1t细胞克隆的成对tcrα和β基因并使其表达，赋予对肿瘤细胞的mr1的识别能力，其与原始mr1t细胞显示的mr1识别类似，并且被抗mr1?mab完全阻断(图4a?图c)。在对照实验中，代表性mait细胞克隆的tcrα和β基因的转移赋予了仅在存在大肠杆菌抗原的情况下以mr1依赖性方式识别a375?mr1细胞的能力(图4d)。这些数据突出了tcr在介导肿瘤细胞的mr1t细胞识别中的关键作用，并且表明mr1t细胞tcr基因转移可以有效地将选定的t细胞的反应性重定向至表达mr1的肿瘤细胞。131.mr1t细胞克隆对肿瘤细胞的鉴别识别132.已经产生了大量的mr1t细胞克隆与表达mr1的a375黑素瘤细胞反应，发明人接下来研究了其是否也能识别组成型表达表面mr1的其他类型的肿瘤细胞，包括thp?1髓单核细胞、huh7肝细胞瘤细胞、hct116结肠癌细胞和ls 174t杯状结肠腺癌细胞。所有这些细胞类型在微生物抗原存在下以mr1依赖性方式支持mait细胞活化(图5a)。相同的细胞能够在不同程度上诱导选定的mr1t细胞克隆的无菌活化。大多数测试的mr1t细胞克隆识别thp?1细胞，随后是huh7肝细胞瘤细胞、ls174t杯状细胞和hct116结肠癌细胞(图5b)。重要的是，所有反应都被抗mr1 mab阻断。133.这些数据进一步证实mr1t细胞是限于非多态性抗原呈递分子mr1的肿瘤反应性t细胞的新型的和多样性的细胞。134.mr1t细胞识别肿瘤细胞中存在的mr1结合抗原135.发明人接下来研究了mr1t细胞对肿瘤细胞的反应性的基础。首先，他们寻求明确排除mr1t细胞克隆能够识别微生物抗原的可能性，类似于mait细胞。而对照mait细胞克隆仅在大肠杆菌裂解物存在下与a375?mr1细胞反应，不同的mr1t细胞克隆的活化没有被大肠杆菌裂解物增强(图6a)。与这些数据一致，mr1阴性的a375?wt细胞未能刺激任何类型的t细胞，无论大肠杆菌裂解物是否加入(图6a)，重要的是抗?mr1 mab有效阻断mr1t和mait细胞两者反应(图6a)。这些发现证实了存在于大肠杆菌中并刺激mait细胞的微生物配体不会刺激测试的mr1t细胞。136.然后，发明人测试了mr1t细胞对已知的mr1配体6?fp和ac?6?fp的反应，其先前已报道刺激trav1?2阴性t细胞的稀有亚组并抑制微生物抗原的mait细胞活化。在存在6?fp或ac?6?fp配体的情况下mr1t细胞刺激受损，其也损害了大肠杆菌对对照mait细胞的刺激，但不破坏由相同apc呈递的对同源抗原的对照tcrγδ细胞反应，因此排除了化合物毒性(图6b、图c和图7a至图c)。值得注意的是，当转录靶a375细胞以表达具有缺陷配体结合能力的突变mr1分子时，6?fp或ac?6?fp未能抑制mr1t细胞或mait细胞的活化(通过赖氨酸43突变为丙氨酸，a375?mr1 k34a，用配体阻断席夫碱的形成；图6b、图c和图7d、图e)。用6?fp或ac?6?fp观察到的特异性抑制表明mr1t细胞i)不识别6?fp和ac?6?fp；ii)与mr1结合的细胞抗原反应；和iii)受不需要与mr1形成希夫碱的配体刺激。137.为了获得关于识别的抗原的起源的进一步信息，发明人研究肿瘤靶细胞的刺激能力是否依赖于培养基成分，因为一些mr1配体，例如6?fp可能源自用于细胞培养的rpmi 1640培养基中存在的叶酸。将thp?1和a375?mr1细胞彻底洗涤并在仅补充有5％人血清的磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)中培养4天。每天洗涤细胞，然后用于刺激dgb129 mr1t细胞，并在pbs中进行t细胞活化测定。在rpmi 1640或pbs中生长的thp?1和a375?mr1细胞显示相同的刺激能力(图8a、图b)，因此表明培养基成分不使mr1t细胞活化。为了直接研究刺激性抗原是否存在于靶肿瘤细胞中，本发明人然后使用两种类型的肿瘤裂解物作为抗原来源进行t细胞活化测定。第一裂解物从体外培养的thp?1细胞获得，而第二裂解物是在切除后立即从小鼠乳腺肿瘤制备的。获得两种疏水性和四种亲水性分离物，并使用组成型表达低水平mr1的thp?1细胞作为apc进行测试。dgb129克隆仅与n4分离物反应，其含有从新鲜移植的小鼠肿瘤和体外培养的thp?1细胞两者分离的高度亲水性化合物(图8c、图d)。这些结果排除了刺激性抗原来源于rpmi 1640成分的可能性并表明了其细胞来源。发明人还用另一种代表性mr1t细胞克隆dgb70测试了thp?1裂解物产生的分离物。dgb70细胞识别分离物n3而不识别分离物n4(图8e)，表明至少两种不同的复合物不同地刺激两种mr1t克隆。将相同的分离物加载到塑料结合的mr1分子上并显示出替代和特异性刺激能力，即n3仅刺激dgb70细胞，而n4仅刺激dgb129细胞(图8f)。在不存在n3和n4分离物的情况下，两个克隆不与mr1反应，进一步表明需要特异性抗原。138.总之，这些数据表明mr1t细胞识别与不是源自培养基的配体复合的mr1，并且也存在于体内生长的肿瘤细胞中。139.mr1t细胞显示出不同的抗肿瘤反应140.为了评估mr1t细胞的抗肿瘤活性，本发明人测试了其在体外直接杀伤肿瘤细胞的能力。两种代表性的mr1t细胞克隆(dgb129和dgb70)以各种效应子：靶比例有效杀伤表达mr1的thp?1和a375细胞两者(图9a、图b)。对照mait细胞克隆未能杀伤这两种细胞类型，尽管当靶向被大肠杆菌感染时其完全能够杀伤(未示出)。这些结果表明mr1t细胞显示出对表达mr1的肿瘤细胞的特异性细胞毒活性。141.已经发现mr1 t细胞识别并杀伤了髓单核细胞肿瘤细胞系thp?1，发明人接下来解决了其是否也能识别正常骨髓细胞，这包括来自不同供体的单核细胞和单核细胞衍生的树突细胞(mo?dc)。任何测试的mr1t细胞克隆都未识别单核细胞(未示出)。相反，一些mr1t细胞克隆以mr1依赖性方式与mo?dc反应(图9c)。有趣的是，用代表性dgb129 mr1t细胞克隆进行的实验表明，mo?dc的识别不会导致mo?dc杀伤(未示出)，而是通过mo?dc促进cd83和cd86活化标记物的上调(图9d)。值得注意的是，抗?mr1 mab完全抑制了dgb129细胞诱导的mo?dc的活化(图9d)。这些数据表明，一些肿瘤反应性mr1t细胞引发直接的抗肿瘤活性并且还促进先天免疫细胞的活化，这对建立有效的抗肿瘤免疫应答具有重要意义。142.当发明人观察到一些mr1t细胞克隆与hct116和ls174t肠肿瘤细胞反应时，他们接下来研究其是否也能识别从肠道活组织检查制备的正常肠上皮细胞(gec)。gec细胞对任何测试的hct116或ls174t反应性mr1t细胞克隆都没有刺激作用(图9f、图g)，因此表明mr1t细胞克隆可能显示胃肠道肿瘤细胞的特异性识别而不对正常肠上皮细胞产生反应。143.为了进一步评估mr1t细胞识别肿瘤的特异性，发明人最终研究了它们是否能与其他类型的正常细胞反应，包括嗜中性粒细胞、nk细胞、b细胞和t细胞。这些细胞中没有一种被测试的mr1t细胞识别(未示出)。144.总的来说，这些数据将mr1t细胞鉴别为人mr1限制性t淋巴细胞的新型和多样性细胞，其i)对各种类型的肿瘤细胞不同反应；ii)显示对肿瘤细胞的细胞毒活性；iii)不识别正常细胞体外?分化的mo?dc和iv)不会杀伤mo?dc而是诱导其活性。这些发现表明mr1t细胞显示出重要的抗肿瘤特性，并且值得开发用于其免疫治疗潜力。145.mr1t细胞在功能上是多样性的146.发明人最终分析了a375?mr1肿瘤细胞刺激后代表性mr1t细胞克隆的细胞因子分泌谱。测试的所有克隆释放ifn?γ(图10a)。然而，发明人还观察到th1(il?2、tnf?α和tnf?β)、th2(il?3、il?4、il?5、il?6、il?10、il?13)和th17细胞因子(il?17a、g?csf、gm?csf)和其他可溶性因子(mip?1β、可溶性cd40l pdgf?aa和vegf的不同表达谱；图10b)。由mr1t细胞表达的细胞因子的可变组合和数量表明该细胞具有相当大的功能可塑性。例如，克隆dga4分泌大量il?17a、il?6、tnf?α和gm?csf，但未能分泌原型th2细胞因子il?4、il?5、il?10或il?13，因此显示出'非典型'th17样表型。相反，克隆tc5a87释放了大量的vegf和pgdf?aa，但只有少量的th1或th2细胞因子，而没有il?17a。值得注意的是，研究的7个克隆中的4个(dgb129、ch9a3、dgb70、jma)显示出细胞因子释放的th2?偏斜特征，这是最近与保护性抗肿瘤免疫相关的功能表型。147.发明人接下来研究了已知由具有不同功能的t细胞亚组差异表达的三种选定趋化因子受体的表达，并且其替代组合表达调节t细胞再循环和向不同归巢位点的迁移。除dga4外，所有mr1t细胞克隆显示高水平的cxcr3(图11)。此外，本发明人观察到ccr4和ccr6的不同表达模式(图11)，这进一步表明mr1t细胞是多样性的。148.在最后一系列研究中，研究了mr1t细胞是否使用肺实体肿瘤模型在体内维持其肿瘤杀伤能力。静脉内注射表达mr1的a375黑素瘤细胞的小鼠接受dgb129细胞或不处理。在第14天，处死小鼠并计算肺中肿瘤结节的数目。虽然未处理的小鼠显示200至250个结节，但用mr1t细胞处理的小鼠显示1?6个结节(图12)。这些结果证实，体内生长的肿瘤细胞产生刺激mr1t细胞的抗原。重要的是，它们提供了mr1t细胞体内杀伤实体瘤细胞的有效能力的有力证据。149.总之，这些数据表明，此处测试的肿瘤mr1反应性t克隆在表型上和功能上是多样的，因此表明mr1t细胞包括具有不同再循环模式和组织归巢能力的多个亚组，并且可能在肿瘤免疫中具有不同的作用。最后，这些数据将mr1t细胞鉴别为识别mr1：肿瘤相关抗原复合物并可参与具有多种效应功能的抗肿瘤免疫应答的人t淋巴细胞的新群体。150.表格1.选定mr1反应性t细胞克隆的表型。[0151][0152]表格2.由人mr1t细胞识别的肿瘤细胞系。[0153][0154]以下示例进一步说明了应用本发明的临床工作流程：[0155]筛选表达mr1的癌症[0156]使用对人mr1特异的mab和mr1 mrna的pcr扩增分析癌症患者的组织新鲜或新鲜冷冻组织活检组织的mr1表达。[0157]癌症治疗，示例1：选定用于识别表达原代mr1的癌细胞的最佳mrt1 tcr基因。[0158]i.分离体外的原代mr1+癌细胞用于刺激先前表征的mr1t细胞克隆的库。每个克隆表达不同的tcr基因并识别不同类型的癌细胞。[0159]ii.选定对患者的癌细胞最佳反应的mr1t细胞克隆，并将其tcr基因用于tcr基因疗法。根据细胞因子释放和/或表面标记物表达测定反应。通过内部(细胞因子)或表面标记染色用对测定的活化标记物具有反应性的抗体测定细胞，例如但不限于cd3、cd69、cd137、cd150和/或icos(表面标记物)和inf?γ以及gm?csf(细胞因子)。[0160]iii.当可用的可溶性mr1t tcr将被多聚化并用于染色从肿瘤活组织检查分离的肿瘤细胞。与肿瘤细胞结合的mr1t tcr多聚体将允许快速选定适合该患者的基因疗法的mr1t tcr。[0161]iv.几种循环的患者t细胞群可用作受体t细胞(原初细胞、中枢记忆、效应记忆、cd4+、cd8+或cd4，cd8双阴性t细胞)。选定原初细胞，当其被识别mr1?肿瘤抗原的tcr基因转导时，允许未标记的t淋巴细胞在肿瘤细胞存在下成熟。使用中枢和效应记忆细胞是因为它们在识别表达mr1的肿瘤细胞时提供即时增殖和效应功能(肿瘤杀伤)。选定cd4细胞以提供足够数量的t辅助细胞，其促进具有抗肿瘤功能的其他细胞的增长和扩增。选定cd8 t细胞以促进肿瘤细胞的杀伤。选定cd4至cd8双阴性t细胞用于其先天样功能，诸如立即释放大量杀伤效应分子(tnfα、颗粒酶和颗粒溶素)。[0162]v.表达转导的tcr基因和具有选定的效应子功能的t细胞用于过继细胞疗法(act)。[0163]来自患者外周血的t细胞用对表面标记物(cd4、cd8、cd27、cd45ra、cd57)特异的单克隆抗体染色并分选。用human t?activator cd3/cd28(thermofisher)激活每个分选的群体，并在24小时后用编码为个体患者选定的mr1t tcr的tcr基因转染。这产生了修饰的t细胞制剂(受体t细胞)。在一些情况下，受体t细胞也通过基因编辑方法修饰以失活pd1、ilt2和ilt4抑制基因或用cd137和cd134基因转导以促进细胞存活、细胞扩增和增强抗癌效应子功能。[0164]受体的癌症患者使用非清髓性化疗制备方案(60mg/kg环磷酰胺施用2天；2525mg/m2氟达拉滨施用5天)进行淋巴细胞清除，随后将t细胞和il?2转移至耐受性720，000iu/kg。在某些情况下，200或1200厘戈瑞(cgy；1gy＝100拉德)将全身照射加入制备方案中。将表达mr1t外源tcr基因(修饰的t细胞制剂)的t细胞转移到受体中。[0165]将tcr基因克隆到安全的重组慢病毒载体中(参见例如provasi等人，nat med 18,807?815(2012))，其含有自杀基因并且在不存在其他辅助病毒的情况下不能产生成熟的病毒颗粒。在一些情况下，将tcr基因克隆到含有自杀基因的载体中(例如，参见greco等人，front pharmacol 6,95(2015))，从而降低了由不需要的基因插入引起的风险。在一些情况下，编码tcr mr1t基因的rna在受体细胞中转染(参见例如zhao等人。分子疗法13,151,2006))。[0166]癌症疗法，示例2：从待治疗患者的肿瘤浸润淋巴细胞(til)中分离mr1t细胞。[0167]vi.根据我们先前建立的方案(de libero，同上)，从癌组织活组织检查制备自体til。[0168]vii.使用补充有il?2、il?7和il?15的培养基，在体外扩增t细胞2至3周。[0169]viii.测试扩增的t细胞对自体mr1+癌细胞的反应性。增加活化标记物(cd137、cd150、cd69、icos)表面表达的t细胞被认为是癌症特异性的，如果它们被抗mr1单克隆抗体的存在所抑制，则它们被认为是mr1依赖性的。[0170]如上所述，癌症反应性t细胞根据上述活化标记物之一的表达进行分选，并扩增以及用于act。[0171]序列[0172]如果以下说明书页面中包含的序列与以文本文件形式并行提交的序列方案之间存在差异，则以本说明书中的以下序列为准。[0173]全长tcrα和β蛋白序列，包括前导序列。[0174]cdr3序列用下划线显示[0175]seq id 001 tcrα新克隆1[0176]mamllgasvlilwlqpdwvnsqqknddqqvkqnspslsvqegrisilncdytnsmfdyflwykkypaegptflisissikdknedgrftvflnksakhlslhivpsqpgdsavyfcaaqiynqggklifgqgtelsvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0177]seq id 003 tcrα新克隆2[0178]mislrvllvilwlqlswvwsqrkeveqdpgpfnvpegatvafnctysnsasqsffwyrqdcrkepkllmsvyssgnedgrftaqlnrasqyisllirdsklsdsatylcvvtgnqfyfgtgtsltvipniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0179]seq id 005 tcrα新克隆3[0180]mltasllraviasicvvssmaqkvtqaqteisvvekedvtldcvyetrdttyylfwykqppsgelvflirrnsfdeqneisgryswnfqkstssfnftitasqvvdsavyfcalseepsntgklifgqgttlqvkpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0181]seq id 002 tcrβ新克隆1[0182]mgirllcrvafcflavglvdvkvtqssrylvkrtgekvflecvqdmdhenmfwyrqdpglglrliyfsydvkmkekgdipegysvsrekkerfslilesastnqtsmylcassfssgkqyfgpgtrltvtedlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg[0183]seq id 004 tcrβ新克隆2[0184]masllffcgafyllgtgsmdadvtqtprnritktgkrimlecsqtkghdrmywyrqdpglglrliyysfdvkdinkgeisdgysvsrqaqakfslslesaipnqtalyfcatsdvgtgdtgelffgegsrltvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg[0185]seq id 006 tcrβ新克隆3[0186]mgirllcrvafcflavglvdvkvtqssrylvkrtgekvflecvqdmdhenmfwyrqdpglglrliyfsydvkmkekgdipegysvsrekkerfslilesastnqtsmylcassrllaggqneqffgpgtrltvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsesyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg[0187]全长tcrα和β蛋白序列，包括前导序列。[0188]seq id no 013 tcrα克隆4[0189]mwgvfllyvsmkmggttgqnidqptemtategaivqinctyqtsgfnglfwyqqhageaptflsynvldgleekgrfssflsrskgysylllkelqmkdsasylcavmdssyklifgsgtrllvrpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0190]seq id no 014 tcrα克隆5[0191]mllitsmlvlwmqlsqvngqqvmqipqyqhvqegedfttycnssttlsniqwykqrpgghpvfliqlvksgevkkqkrltfqfgeakknsslhitatqttdvgtyfcaaaggtsygkltfgqgtiltvhpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0192]seq id no 015 tcrα克隆6[0193]mktfagfsflflwlqldcmsrgedveqslflsvregdssvinctytdssstylywykqepgaglqlltyifsnmdmkqdqrltvllnkkdkhlslriadtqtgdsaiyfcaetwtdrgstlgrlyfgrgtqltvwpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0194]seq id no 016 tcrα克隆7[0195]mamllgasvlilwlqtdwvnsqqknddqqvkqnspslsvqegrisilncdytnsmfdyflwykkypaegptflisissikdknedgrftvflnksakhlslhivpsqpgdsavyfcaaslynqggklifgqgtelsvkpniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0196]seq id no 017 tcrα克隆8[0197]meknplaapllilwfhldcvssilnveqspqslhvqegdstnftcsfpssnfyalhwyrwetakspealfvmtlngdekkkgrisatlntkegysylyikgsqpedsatylcasgdsgyalnfgkgtsllvtphiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss[0198]seq id no 018 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