优先发表LncRNA H19调控miR-214／Caspase-1轴参与大鼠慢性
慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指由于心肌梗死、炎症、血流动力学负荷过重等引起心脏结构、功能异常，进而导致心室充盈、射血功能下降，无法将静脉回流的血液排出心脏，动脉血液供应不足，引发心力衰竭[]。据调查，中国CHF患病率高达0.9%，而且在逐年增加，5年生存率与恶性肿瘤相似[]。近年来，与CHF相关的发病率和死亡率仍在上升[-]。因此，需要鉴定针对该病症的新型治疗靶标。据报道，炎症与CHF发病发展密切相关[]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是心脏发育和心脏疾病的强大调节因子[]。已知lncRNA H19在胚胎组织中大量表达，与心脏发育和血管形成有关[]，并且已有研究[]表明lncRNA H19可作为肺动脉高血压右心衰竭的一种新的生物标志物和治疗靶点；然而lncRNA H19是否参与CHF的病理进展及其潜在功能仍不清楚。另有研究[]发现CHF患者外周血中微小RNA-214（microRNA-214，miR-214）水平显著低于健康受试者，卡维地洛发挥心脏保护作用的机制之一可能是通过增加miR-214表达；miRNA-214过表达可抑制心肌细胞凋亡、氧化应激反应和炎症反应，减轻脑缺血-再灌注大鼠的心肌损伤[]，表明miRNA-214是一种重要的心脏保护因子。笔者通过starbase数据库预测到lncRNA H19包含miR-214的结合位点，miR-214可能是lncRNA H19的靶基因。因此，本研究拟以CHF大鼠为对象，通过沉默lncRNA H19、沉默miR-214探究lncRNA H19对CHF的影响及可能的作用机制，为CHF的诊断及治疗提供新的思路与参考。
SPF级健康SD雄性大鼠，体重（300±10）g，10周龄，由北京维通利华动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2019-0011。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，环境温度为（24±2）℃，湿度为50%～60%，12 h明暗交替，自由饮水和摄食。饲养1周充分适应环境后开始实验。
大鼠lncRNA H19小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、lncRNA H19 siRNA阴性对照、miR-214 siRNA、miR-214 siRNA阴性对照的重组腺病毒、PCR引物均由上海吉玛基因公司合成。肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）（批号RA20038）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）（批号RA20647）、B型脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）（批号RA20446）、N末端B型钠尿肽前体（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）（批号RA20318）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批号RA20020）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）（批号RA20058）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批号RA20607）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批号RA20035）酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂（批号C0137）、RIPA裂解液（批号P0018K）和BCA试剂盒（批号P0012S）均购自上海碧云天生物技术有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒（批号SL-50237）、TRIzol提取试剂盒（批号SL-10673）、反转录试剂盒（批号SP-20792）及PCR试剂盒（SYBR? Premix Ex TaqTM）（批号SP-70018）均购自上海沪震生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2基因（B lymphocytoma-2 gene，Bcl-2）（批号ab196495）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）（批号ab53154）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）（批号ab238972）、β-肌动蛋白（β-actin）（批号ab8227）单克隆抗体、羊抗鼠二抗（批号ab205718）均购自美国Abcam公司。超高分辨率小动物超声影像系统（型号Vevo 2100）购自加拿大VisualSonics公司；多功能酶标仪（型号iMark680）、流式细胞仪（型号C6）、荧光显微镜（型号XD-202）均购自中生（苏州）医疗科技有限公司；荧光定量PCR仪（型号SLAN-48P）、凝胶成像仪（型号JY02G）均购自上海透景生命科技股份有限公司。
参照文献[-]采用腹主动脉缩窄术建立CHF大鼠模型。大鼠于造模前禁食不禁水12 h，腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，连接肢体心电图电极和小动物呼吸机，腹部脱毛备皮，碘伏消毒，沿腹中线打开腹腔，拨开肠道，暴露腹主动脉，用4-0号缝合线将腹主动脉与6号钝不锈钢针结扎，扎紧后取出不锈钢针，结扎处明显缩窄，心电图ST段明显抬高为结扎成功的标志，缝合肌肉、皮肤；术后腹腔注射青霉素20万单位/kg预防感染。饲养5周后用超高分辨率小动物超声影像系统检测左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），若LVEF<60%即为模型成功[]。结果显示，造模大鼠出现射血分数保留型心力衰竭，共93只大鼠参与造模，成功造模84只。
将84只造模成功大鼠随机分为模型组、si-NC组（转染lncRNA H19 siRNA阴性对照）、si-H19组（转染lncRNA H19 siRNA）、si-miR-NC组（转染miR-214 siRNA阴性对照）、si-miR-214组（转染miR-214 siRNA）、si-H19+si-miR-NC组（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA阴性对照共转染）、si-H19+si-miR-214组（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA共转染），每组12只。另设假手术组12只（大鼠只穿线不结扎，其余操作同模型组）。各转染组大鼠使用微注射器将100 μL相应的腺病毒溶液（1×109 PFU）经尾静脉注入，假手术组和模型组大鼠注射等量生理盐水，每周1次，连续4周。
干预4周后，麻醉大鼠，采用超高分辨率小动物超声影像系统测量大鼠左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、LVEF、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。
心功能检测完成后，腹主动脉取血，并在高速冷冻离心机中以3 000 r/min离心10 min，取上清。根据试剂盒说明书，通过ELISA法检测大鼠的CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平。
取血完成后，处死大鼠，打开胸腔，取出心脏，并用预冷的生理盐水洗涤残留血液。将大鼠心脏分为三部分，一部分液氮速冻后，?80℃冰箱保存待测；一部分心肌组织剪碎后胰酶消化，用于流式细胞术；另一部分心肌组织，4%的多聚甲醛溶液固定，4℃过夜，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察心肌组织病理变化。
心肌组织在充分剪碎后，加入适量的胰酶消化液，37℃混合裂解30 min，70 μm滤网过滤后，1 000 r/min，离心10 min，弃去上清，重悬细胞，制成单细胞悬液。将100 μL的细胞悬液加入5 mL流式管中，然后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min后，用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。
取?80℃冰箱保存的心肌组织，用TRIzol试剂盒提取心肌组织的总RNA，紫外分光光度法检测总RNA的浓度和纯度，使用反转录试剂盒进行反转录，收集cDNA用于PCR扩增。扩增体系：cDNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM 10 μL，加入无核酸酶的水使最终体积为20 μL。扩增条件：在95°C孵育10 min；95°C预变性5 s，60°C退火并延伸30 s，总共40个循环。每个样品设置3个重复孔，并且实验进行3次。引物序列见，GAPDH用作lncRNA H19的内源性对照，而U6用作miR-214的内源性对照，并使用2-Δ?Ct方法分析lncRNA H19、miR-214表达水平。
取?80℃冰箱保存的心肌组织，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，静置后离心，提取上清液为总蛋白溶液。用BCA法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（30 μg/孔），凝胶电泳，湿转法转膜，使用5%脱脂奶粉阻断与膜的非特异性结合，然后将膜与Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗孵育过夜，然后与羊抗鼠二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL显色，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。
生物信息学分析预测，H19包含针对miR-214的结合位点。为了验证它们是否可以直接相互作用，我们构建了重组质粒pmirGLO-H19-WT和pmirGLO-H19-Mut。大鼠H19野生型序列（H19-WT）和缺少miR-214结合位点的突变体衍生物（H19-Mut）被亚克隆到荧光素酶基因编码区的下游。将HEK293T细胞接种到24孔板中，使用Lipofectamine 2000试剂与荧光素酶报道质粒和miR-214模拟物或miR-NC共转染。转染后48 h，使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）检查每组中的荧光素酶活性。
所有统计分析均使用SPSS 25.0软件进行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析用于多组之间的比较，进一步两两比较采用SNK-q检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
本研究经六盘水市人民医院伦理委员会批准，批准编号：LSZ-2021-004。
与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织lncRNA H19水平明显升高，miR-214水平明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠心肌组织lncRNA H19、miR-214水平无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠心肌组织lncRNA H19水平明显降低，miR-214水平明显升高（P＜0.05），si-miR-214组大鼠心肌组织miR-214水平明显降低（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠miR-214水平明显降低（P＜0.05）；见。
与假手术组相比，模型组大鼠LVESD、LVEDD明显升高，LVEF、LVFS明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组心功能无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠LVESD、LVEDD明显降低，LVEF、LVFS明显升高（P＜0.05），si-miR-214组大鼠LVESD、LVEDD明显升高，LVEF、LVFS明显降低（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠LVESD、LVEDD明显升高，LVEF、LVFS明显降低（P＜0.05）；见、。
与假手术组相比，模型组大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明显降低（P＜0.05），si-miR-214组大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明显升高（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明显升高（P＜0.05）；见。
与假手术组相比，模型组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明显降低（P＜0.05），si-miR-214组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明显升高（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明显升高（P＜0.05）；见。
HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞形态规则、排列整齐、心肌纤维完整，未见心肌细胞水肿、坏死；模型组大鼠心肌严重受损，细胞形态不规则、排列紊乱、局部肌纤维横纹消失，心肌细胞水肿变性，大量炎性细胞浸润，受损严重的心肌细胞可见小灶状或片状坏死；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠心肌损伤并未发生明显改善，si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠心肌损伤明显减轻，可见轻度心肌细胞水肿、肥大，少量炎性细胞浸润，而si-miR-214组大鼠心肌损伤明显加重；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠心肌损伤加重；见。
与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠心肌细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），si-miR-214组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；见、。
与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平明显升高，Bcl-2/Bax比值明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，si-NC组和si-miR-NC组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平和Bcl-2/Bax比值无明显变化（P＞0.05），si-H19组和si-H19+si-miR-NC组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明显升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明显降低（P＜0.05），si-miR-214组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明显降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与si-H19+si-miR-NC组相比，si-H19+si-miR-214组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明显降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明显升高（P＜0.05）；见、。
通过starbase数据库预测lncRNA H19包含miR-214的结合位点；见。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-214高表达明显抑制了pmirGLO-H19-WT质粒的荧光素酶活性（P＜0.05），对pmirGLO-H19-Mut质粒的荧光素酶活性无影响；见。
CHF不是独立的疾病，而是各种心脏病发展的最后阶段，严重威胁人类健康[]。研究表明，lncRNA可作为miRNA的竞争内源性RNA，在CHF进展中发挥至关重要的作用，是一类有前途的诊断生物标志物[]。已证实lncRNA H19参与调控心肌肥厚、心肌纤维化发生与发展，可以作为治疗心肌梗死的新靶点[]。lncRNA H19在CHF中的作用与机制值得进一步研究。
炎症和细胞凋亡是导致CHF和随后的心脏重塑的两个关键因素。BNP和NT-proBNP是确定心力衰竭诊断和预后的黄金标志物[]。TNF-α和IL-6是重要的炎症介质，在心力衰竭中起致病作用[]。NLRP3炎症小体在导致心力衰竭进展的各种病理条件下被激活，是心力衰竭期间心脏炎症的关键介质[]。IL-1β、IL-18是NLRP3炎症小体激活的细胞因子，已有研究[]显示阻断IL-1β可降低心力衰竭患者的住院率和死亡率。lncRNA H19是参与心肌炎症反应和细胞凋亡的关键介质[]。本研究发现在CHF模型大鼠心肌组织中lncRNA H19水平明显高于假手术组；提示，lncRNA H19可能参与CHF的病理过程。为了鉴定lncRNA H19在体内的作用，大鼠尾静脉注射si-H19稳定地下调lncRNA H19水平，结果显示CHF模型大鼠心功能明显好转，血清心肌损伤标志物（CK-MB、cTnI）和心力衰竭标志物（BNP、NT-proBNP）[]以及炎症相关因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6）水平明显降低，心肌损伤明显减轻，心肌细胞凋亡明显减少，心肌组织Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明显升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明显降低；进一步证实下调lncRNA H19可降低炎症因子水平和心肌细胞凋亡，改善CHF。
此外，本研究还发现在CHF模型大鼠心肌组织中miR-214水平明显低于假手术组大鼠，而在下调lncRNA H19后，miR-214水平呈升高趋势。已有研究[]表明miRNA-214的过表达可抑制心肌细胞凋亡和炎症反应，减轻脑缺血/再灌注大鼠的心肌损伤。我们推测miRNA-214也可能参与CHF的病理过程，为了验证此猜想，我们通过尾静脉注射si-miR-214的重组腺病毒沉默miR-214，发现miR-214沉默后CHF模型大鼠心肌损伤、炎症反应和心肌细胞凋亡较模型组明显加重，而采用si-H19和si-miR-214共转染后，si-miR-214可逆转si-H19对CHF大鼠的心脏保护作用。我们通过starbase数据库预测lncRNA H19包含针对miR-214的结合位点。随后采用双荧光素酶报告法，用miR-214 mimic与pmirGLO-H19-WT共转染HEK293T细胞，结果显示其荧光素酶活性明显下降；说明lncRNA H19可靶向负调控miR-214；下调lncRNA H19的表达，可上调miR-214水平，减轻CHF大鼠心肌损伤。
细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种高度调节的细胞死亡过程，焦亡不仅会引起局部炎症，还会导致炎症反应的放大；通过药理学或基因干预来抑制这一过程在许多情况下具有心脏保护作用[]。因此，该过程是心血管疾病治疗干预的潜在目标。细胞焦亡由两种主要的信号通路驱动，一种由Caspase-1介导，另一种由Caspase-4/5/11介导。Caspase-1依赖的细胞焦亡途径是经典的信号转导途径，NLRP3炎性小体被多种外源性或内源性刺激物激活后，活化Caspase-1裂解为具有活性的P20及P10，促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，诱导细胞发生焦亡[]。据报道，通过激活NLRP3/Caspase-1信号通路可触发细胞焦亡和心脏肥大[]。已有生物信息学分析和双荧光素酶测定法显示，Caspase-1是miR-214的靶基因，miR-214降低可激活Caspase-1，促进下游细胞因子如IL-1β和IL-18的裂解为成熟形式，参与心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化[]。Yang等[]研究发现沉默LncRNA KCNQ1OT1，可通过上调miR-214，下调Caspase-1表达，抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。本研究结果显示，在CHF模型大鼠中IL-1β、IL-18和Caspase-1的表达均明显高于假手术组，这提示CHF大鼠心肌细胞中可能存在细胞焦亡。下调lncRNA H19表达后，miR-214的表达水平升高，同时Caspase-1、IL-1β、IL-18水平降低，而miR-214沉默后，IL-1β、IL-18和Caspase-1的表达进一步升高；采用si-H19和si-miR-214共转染后，si-miR-214可逆转si-H19对Caspase-1、IL-1β、IL-18表达的抑制作用，这提示沉默lncRNA H19表达可能通过调控miR-214/Caspase-1轴参与CHF的病理过程。
综上所述，沉默lncRNA H19可通过靶向上调miR-214的表达，抑制Caspase-1的表达，并抑制心肌细胞凋亡和炎症反应，减轻CHF大鼠的心肌损伤。因条件限制本研究仅从动物水平进行了探究，后续可考虑采用心肌细胞，从体外细胞水平进行深入研究。
利益冲突：无。
作者贡献：张苡榕、唐一锋负责实验设计、操作、取材、指标检测、数据整理分析以及论文初稿撰写；李勇军、柳丽、李翔负责实验指导、论文设计和论文审阅；梅丽、彭媚、陈保林负责论文审阅与修改。