新型抗体以及TREG消耗性抗体和免疫刺激性抗体的组合使用的制作方法
本发明涉及用于癌症治疗的首先treg消耗性抗体分子和然后免疫刺激性抗体分子的依次施用。本发明还涉及用于此类治疗的新型抗体，包含新型抗4-1bb抗体和新型抗ox40抗体。
背景技术：
免疫调节性mab的有前景的临床结果使人们重新相信免疫系统是控制癌症的关键。最近，人们对将这些mab分类为检查点阻断剂(拮抗剂)或共刺激性分子激活剂(激动剂)产生了质疑，发现这两种类型的实例都可以通过激活性fcγr的参与和抑制性调节性t细胞(treg)的消耗来对抗肿瘤。与这些发现相反，抗cd40mab依赖于抑制性fcγr的交联来产生激动性免疫刺激。因此，尽管免疫调节性mab为癌症免疫治疗提供了可观的前景，但各种mab所采用的效应子机制及因而其最佳应用仍有待确定。
当在难治性恶性肿瘤中进行试验时，如伊匹单抗(ipilimumab)(抗ctla4)、抗pd-1/pd-l1和抗cd40等免疫调节性mab已显示出阳性结果，尽管在少数患者中(1-4)。这些有前景的结果有助于重振人们的观念，即免疫系统可以是控制癌症的关键。生成这些mab的目的是靶向t细胞或apc上的关键分子调节剂，并通过阻断抑制信号(检查点阻断剂)或传递共刺激信号(激动剂)来增强抗癌免疫力。最近，当发现所有均靶向t细胞的抗ctla4、抗gitr和抗ox40的治疗活性涉及抑制性cd4+t调节性细胞的缺失时，这种二元分类就引起了质疑，所述缺失取决于激活性fcγr的共同参与(5-7)。相反，靶向激动剂apc的抗cd40mab的活性需要抑制性fcγr的共同参与，以促进有效的mab交联，这对于cd40信号传导和免疫刺激是必不可少的(8-10)。因此，尽管免疫调节性mab为癌症免疫治疗提供了可观的前景，但所采用的机制以不明确的方式取决于mab的fab和fc区，并且可能取决于所靶向的细胞类型。了解treg消耗与直接免疫刺激的相对重要性对于免疫调节性mab的开发和向患者的成功转化至关重要。
技术实现要素：
本发明基于证明抗4-1bbmab可以在实体瘤中采用直接免疫刺激或treg消耗的研究，其主要机制取决于抗体同种型和fcγr可用性。重要的是，消耗和免疫刺激似乎是竞争的机制，可能受到fcγr参与的限制。导致本发明的研究进一步表明，依次施用同种型不同的抗4-1bbmab或同种型最佳的抗4-1bbmab，然后施用抗pd-1mab以最初删除treg并然后刺激cd8t细胞会导致应答增强，从而增强治疗效果并改善预后。此外，发明人设计了带有人igg2铰链区‘b’的消耗性抗4-1bbmigg2a(migg2a/h2b)以提供不依赖fcγr的激动作用，并证明所述单个mab能够利用两种机制来增强治疗效果。
然后，这一范围通过以下证明得到了扩大：除抗4-1bbmab以外还可以用另外的抗体(被称为treg消耗性抗体分子，如特异性结合于属于肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的靶标的抗体分子，例如treg消耗性抗4-1bb抗体或treg消耗性抗ox40抗体)与免疫刺激性抗体分子(如免疫刺激性抗4-1bb抗体、免疫刺激性抗ox40抗体或免疫激活性pd-1阻断抗体)的结合来实现treg消耗和随后的免疫刺激，其中施用顺序对于实现期望效果是重要的。所述研究还导致了新型抗4-1bb抗体和新型抗ox40抗体的开发。
因此，本发明涉及一种用于癌症治疗的treg消耗性抗体分子，其中所述treg消耗性抗体分子与免疫刺激性抗体分子一起依次施用，其中在施用所述免疫刺激性抗体分子之前施用所述treg消耗性抗体分子。
本发明进一步涉及一种治疗受试者癌症的方法，所述治疗包括施用treg消耗性抗体分子，然后依次施用免疫刺激性抗体分子。
本发明进一步涉及一种抗4-1bb抗体分子，其选自由包含选自以下的cdr中的一个或多个的抗体分子组成的组：seq.id.no:1-6、9-14、17-22、25-30、33-38、41-46、49-54、57-62、65-70、153-158和163-168。在本文中，“一个或多个”是指抗体分子包含所示序列中的1个、2个、3个、4个、5个或6个序列，即所示序列中1-6个序列。因此，所述抗4-1bb抗体分子可以包含选自seq.id.no:1-6的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:9-14的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:17-22的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:25-30的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:33-38的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:41-46的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:49-54的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:57-62的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:65-70的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:153-158的cdr中的1-6个；或选自seq.id.no:163-168的cdr中的1-6个。
本发明进一步涉及对上述抗4-1bb抗体分子进行编码的核苷酸。
本发明进一步涉及一种抗ox40抗体分子，其选自由包含选自以下的cdr中的一个或多个的抗体分子组成的组：seq.id.no:73-78、81-86、89-94、97-102、105-110；seq.id.no:113-118；seq.id.no:121-126；seq.id.no:129-134；seq.id.no:137-142；seq.id.no:145-150；以及seq.id.no:171-176。再次地，在本文中，“一个或多个”是指抗体分子包含所示序列中的1个、2个、3个、4个、5个或6个序列，即所示序列中1-6个序列。因此，所述抗ox40抗体分子可以包含选自seq.id.no:73-78的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:81-86的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:89-94的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:97-102的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:105-110的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:113-118的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:121-126的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:129-134的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:137-142的cdr中的1-6个；选自seq.id.no:145-150的cdr中的1-6个；或选自seq.id.no:171-176的cdr中的1-6个。
本发明进一步涉及包含上述核苷酸的载体。
本发明进一步涉及包含上述核苷酸和/或上述载体的宿主细胞。
具体实施方式
调节性t细胞、treg细胞，treg或treg(以前被称为抑制性t细胞，有时也被称为抑制性调节性t细胞)是能够抑制正常和病理性免疫环境中的其它免疫细胞的t细胞亚群。
通过treg的消耗或treg消耗，我们在本文中指的是通过细胞的物理清除来消耗、缺失或消除treg。具体地，我们指的是肿瘤内treg的消耗。
效应t细胞是响应于刺激以抗原:mhc:tcr限制的方式激活、攻击或破坏抗原表达性细胞的t细胞或t淋巴细胞。效应t细胞可以控制癌症并通过激活其它免疫细胞直接(细胞毒性t细胞)或间接(t辅助细胞)根除肿瘤细胞。
抗体是免疫学和分子生物学领域的技术人员熟知的。通常，抗体包含两条重(h)链和两条轻(l)链。在本文中，我们有时将此全尺寸抗体分子称为全尺寸(full-size)或全长(full-length)抗体。抗体的重链包含一个可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)，而抗体的分子轻链包含一个可变结构域(vl)和一个恒定结构域(cl)。可变结构域(有时统称为fv区)与抗体的靶标或抗原结合。每个可变结构域包含三个环，所述环被称为互补决定区(cdr)，其负责靶标结合。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能。根据抗体或免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，可以将所述抗体或免疫球蛋白分为不同类别。免疫球蛋白主要分为五类：iga、igd、ige、igg和igm，并且在人类中，这些类别中几类被进一步划分为亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3和igg4；iga1和iga2。抗体的另一部分为fc结构域(也称为片段可结晶结构域)，其包含每个抗体重链的恒定结构域中的两个恒定结构域。fc结构域负责抗体与fc受体之间的相互作用。
fc受体是膜蛋白，其通常发现于免疫系统细胞的细胞表面上(即fc受体发现于靶细胞膜—也被称为质膜或细胞质膜上)。fc受体的作用是通过fc结构域结合抗体，并将抗体内化到细胞中。在免疫系统中，这可能导致抗体介导的吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
如本文所使用的，术语抗体分子涵盖全长或全尺寸抗体以及全长抗体的功能性片段和此类抗体分子的衍生物。
全尺寸抗体的功能性片段具有与相应的全尺寸抗体相同的抗原结合特性，并且包含与相应的全尺寸抗体相同的可变结构域(即vh和vl序列)和/或相同的cdr序列。功能性片段具有与相应的全尺寸抗体相同的抗原结合特性意味着所述功能性片段与全尺寸抗体结合于在靶标上的相同表位。这种功能性片段可以对应于全尺寸抗体的fv部分。可替代地，这种片段可以是fab，也被称为单价抗原结合片段f(ab)或二价抗原结合片段f(ab')2，所述单价抗原结合片段不含fc部分而所述二价抗原结合片段含有通过二硫键或f(ab')(即f(ab')2的单价变体)连接在一起的两个抗原结合fab部分。这种片段也可以是单链可变片段(scfv)。
功能性片段并不总是含有相应的全尺寸抗体的所有六个cdr。应当理解的是，含有三个或更少cdr区(在一些情况下，甚至是单个cdr或其一部分)的分子能够保留衍生一个或多个cdr的抗体的抗原结合活性。例如，在gao等人,1994,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》,269:32389-93中，描述了完整的vl链(包含所有三个cdr)对其底物具有高亲和力。
含有两个cdr区的分子描述于以下文献中：例如，vaughan&sollazzo2001,《组合化学与高通量筛选(combinatorialchemistry&highthroughputscreening)》,4:417-430。在第418页(右栏—3我们的设计策略)中，描述了仅包含散布在框架区内的h1和h2cdr高变区的微抗体。所述微抗体被描述为能够结合于靶标。vaughan&sollazzo引用了以下文献：pessi等人,1993,《自然(nature)》,362:367-9和bianchi等人,1994,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,236:649-59，所述文献更详细地描述了h1和h2微抗体及其特性。在qiu等人,2007,《自然生物技术(naturebiotechnology)》,25:921-9中，证明了由两个连接的cdr组成的分子能够结合抗原。quiocho1993,《自然》,362:293-4提供了“微抗体”技术的总结。ladner2007,《自然生物技术》,25:875-7指出，含有两个cdr的分子能够保留抗原结合活性。
含有单个cdr区的抗体分子描述于以下文献中：例如，laune等人,1997,《生物化学杂志(jbc)》,272:30937-44，其中证明了衍生自cdr的一系列六肽显示出抗原结合活性，并且注意到完整的单个cdr的合成肽显示出强结合活性。在monnet等人,1999,《生物化学杂志》,274:3789-96中，表明了一定范围的12聚体肽和相关的框架区具有抗原结合活性，并且指出单独的cdr3样肽能够结合抗原。在heap等人,2005,《普通病毒学杂志(j.gen.virol.)》,86:1791-1800中，报道了“微抗体”(含有单个cdr的分子)能够结合抗原，并且表明来自抗hiv抗体的环状肽具有抗原结合活性和功能。在nicaise等人,2004,《蛋白质科学(proteinscience))》,13:1882-91中，表明了单个cdr可以赋予抗原结合活性和对其溶菌酶抗原的亲和力。
因此，具有五个、四个、三个或更少的cdr的抗体分子能够保留衍生所述cdr的全长抗体的抗原结合特性。
抗体分子也可以是全长抗体的衍生物或这种抗体的片段。衍生物具有与相应的全尺寸抗体相同的抗原结合特性，因为所述衍生物与全尺寸抗体结合于在靶标上的相同表位。
因此，通过本文所使用的术语“抗体分子”，我们包含了所有类型的抗体分子及其功性能片段及其衍生物，包含：单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、单链fv(scfv)、fab片段、f(ab')2片段、f(ab')片段、二硫键连接的fvs(sdfv)、抗体重链、抗体轻链、抗体重链的同二聚体、抗体轻链的同二聚体、抗体重链的异二聚体、抗体轻链的异二聚体、此类同二聚体和异二聚体的抗原结合功能性片段。
此外，如本文所使用的，术语“抗体分子”包含所有类型的抗体分子和功能性片段，包含：igg、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、igd和ige。
在一些实施方案中，抗体是人igg1。技术人员了解，小鼠igg2a和人igg1与激活性fcγ受体有效地结合并且能够通过用例如adcp和adcc激活带有免疫细胞(例如巨噬细胞和nk细胞)的激活性fcγ受体来激活靶细胞的缺失。因此，尽管小鼠igg2a是针对小鼠中的缺失的优选同种型，但是人igg1是针对人中的缺失的优选同种型。相反地，已知tnfr超家族激动剂受体(例如4-1bb、ox40、tnfrii、cd40)的最佳共刺激取决于抑制性fcγrii的抗体参与。在小鼠中，已知优先结合抑制性fcγ受体(fcγriib)且仅与激活性fcγ受体弱结合的igg1同种型是针对tnfr超家族靶向性mab的共刺激活性的最佳选择。尽管在人中没有描述小鼠igg1同种型的直接等价物，但可以对抗体进行工程改造，从而使得与激活性人fcγ受体相比，所述抗体对抑制性人fcγ受体表现出类似的结合增强。在被工程改造为表达人激活性fcγ受体和人抑制性fcγ受体的转基因小鼠中，这种经过工程改造的tnfr超家族靶向性抗体在体内的共刺激活性也得到了改善(49)。
如上所述，抗体分子的不同类型和形式包含在本发明中，并且是免疫学领域技术人员已知的。众所周知，用于治疗目的的抗体经常被修饰抗体分子特性的另外的组分修饰。
因此，我们包含了：本发明的抗体分子或根据本发明使用的抗体分子(例如，单克隆抗体分子和/或多克隆抗体分子和/或双特异性抗体分子)包含可检测部分和/或细胞毒性部分。
通过“可检测部分”，我们包含了一种或多种来自由以下组成的组的物质：酶；放射性原子；荧光部分；化学发光部分；生物发光部分。可检测部分允许抗体分子在体外和/或体内和/或离体可见。
通过“细胞毒性部分”，我们包含了放射性部分和/或酶，其中所述酶是胱天蛋白酶和/或毒素，其中所述毒素是细菌毒素或毒液；其中所述细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。
我们进一步包含了：抗体分子可以是分离的形式和/或纯化的形式，和/或可以是聚乙二醇化的。
如上所述，抗体的cdr与抗体靶标结合。本文所述的每个cdr的氨基酸分配符合根据以下的定义：kabatea等人1991,“免疫学上感兴趣的蛋白质的序列(sequencesofproteinsofimmulogicalinterest)”第五版,nih出版号：91-3242,第xv-xvii页。
如技术人员将了解的，还存在用于将氨基酸分配给每个cdr的其它方法。例如，国际免疫遗传学信息系统(imgt(r))(http://www.imgt.org/，以及lefranc和lefranc“免疫球蛋白概况(immunoglobulinfactsbook)”由学术出版社(academicpress)出版,2001年)。
在另外的实施方案中，本发明的抗体分子或根据本发明使用的抗体分子是能够与本文提供的特异性抗体竞争的抗体分子，例如，用于结合于特异性靶标的包含在例如seqidno:1-152中列出的氨基酸序列中的任何序列的抗体分子。
“能够竞争”是指竞争性抗体能够至少部分抑制或以其他方式干扰本文定义的抗体分子与特异性靶标的结合。
例如，这种竞争性抗体分子可能能够将本文所述的抗体分子的结合抑制至少约10％(例如至少约20％、或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约100％)和/或将本文所述的抗体预防或减少与特异性靶标结合的能力抑制至少约10％(例如至少约20％、或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约100％)。
可以通过本领域技术人员所熟知的方法来确定竞争性结合，如酶联免疫吸附测定(elisa)。
可以使用elisa测定来评估表位修饰性或封闭性抗体。适合用于鉴定竞争性抗体的另外的方法描述于以下文献中：《抗体：实验室手册(antibodies:alaboratorymanual)》,harlow&lane，所述文献通过引用并入本文(例如，参见第567页到第569页、第574到第576页、第583页和第590到第612页,1988,cshl,纽约,isbn0-87969-314-2)。
众所周知，抗体特异性结合确定的靶分子或抗原。也就是说，抗体优先且选择性地结合其靶标而不是非靶标分子。
根据本发明的抗体的靶标或根据本发明使用的抗体的靶标在细胞表面上表达，即所述靶标是细胞表面抗原，其将包含抗体的表位(在本文中也被称为细胞表面表位)。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学领域的技术人员容易理解的术语。
通过“细胞表面抗原”，我们包含了：细胞表面抗原暴露于细胞膜的细胞外侧，但可能仅短暂暴露于细胞膜的细胞外侧。通过“短暂暴露”，我们包含了：细胞表面抗原可以被内化到细胞中，或从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外空间。可以通过裂解从细胞膜的细胞外侧释放细胞表面抗原，所述裂解可以由蛋白酶介导。
我们还包含了：细胞表面抗原可能与细胞膜相连，但可能仅与细胞膜短暂相连。通过“短暂相连”，我们包含了：细胞表面抗原可以从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外空间。可以通过裂解从细胞膜的细胞外侧释放细胞表面抗原，所述裂解可以由蛋白酶介导。
我们进一步包含了：细胞表面抗原可以是肽、或多肽、或碳水化合物、或寡糖链或脂质；和/或存在于蛋白质、糖蛋白或脂蛋白上的表位。
评估蛋白质结合的方法是生物化学和免疫学领域的技术人员已知的。本领域技术人员将理解，那些方法可用于评估抗体与靶标的结合和/或抗体的fc结构域与fc受体的结合；以及相对强度或特异性，或这些相互作用的抑制、预防或减少。可以用来评估蛋白质结合的方法的实例为，例如，免疫测定、biacore、蛋白质印迹、放射免疫测定(ria)和酶联免疫吸附测定(elisa)(有关抗体特异性的讨论参见《基础免疫学》第二版,雷文出版社(ravenpress),纽约；第332-336页(1989)。
因此，通过“特异性结合的抗体分子”或“靶标特异性抗体分子”，我们包含了：抗体分子特异性结合靶标但不结合于非靶标，或与靶标相比更弱地结合于非靶标(如具有低亲和力)。
我们还包含了以下意义：与非靶标相比，抗体与靶标特异性结合的强度高至少两倍、或高至少五倍、或高至少10倍、或高至少20倍、或高至少50倍、或高至少100倍、或高至少200倍、或高至少500倍、或高至少约1000倍。
另外，我们包含了以下意义：如果抗体以至少约10-1kd(或至少约10-2kd、或至少约10-3kd、或至少约10-4kd、或至少约10-5kd、或至少约10-6kd、或至少约10-7kd、或至少约10-8kd、或至少约10-9kd、或至少约10-10kd、或至少约10-11kd、或至少约10-12kd、或至少约10-13kd、或至少约10-14kd、或至少约10-15kd)的kd值与靶标结合，则抗体与靶标特异性结合。
如本文所使用的，术语“treg消耗性抗体”是指在施用于受试者(如人)时特异性结合于在treg表面上表达的靶标的抗体，其中这种结合导致treg的消耗。因此，选自与肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的靶标特异性结合的抗体的treg消耗性抗体是在施用于受试者(如人)时结合于在treg表面上表达的属于肿瘤坏死因子受体超家族的靶标的抗体，并且其中这种结合导致treg的消耗。在一些实施方案中，属于肿瘤坏死因子受体超家族的靶标是优先在肿瘤上或在肿瘤微环境中表达的靶标。
在一些实施方案中，除了treg消耗作用外，treg消耗性抗体不具有任何免疫刺激作用。在一些实施方案中，除了treg消耗作用外，treg消耗性抗体还具有免疫刺激作用；在此类实施方案中，treg消耗性抗体具有足够差的免疫刺激活性，以允许在依次施用第二个免疫刺激性抗体之后增强治疗活性。
为了确定抗体是否为本发明意义上的treg消耗性抗体，可以使用体外抗体依赖性细胞毒性(adcc)测定或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定。
可以通过用钙黄绿素am标记靶细胞，然后添加稀释浓度的ab来完成adcc测定。然后将靶细胞与人pbmc一起以50:1的e:t比率在37℃下共培养4小时。将板以4003g离心5分钟以沉淀细胞，然后将上清液转移到白色的96孔板中。使用varioskan(赛默飞世尔科技(thermoscientific))使用485nm的激发波长和530nm的发射波长测量钙黄绿素的释放。如下计算最大释放百分比：最大释放％＝(样品/处理过的triton)*100。
可以通过在室温下用5mmcfse标记靶细胞持续10分钟，然后在完全培养基中进行洗涤来完成adcp测定。然后用稀释浓度的ab对cfse标记的靶标进行调理，然后将所述靶标与bmdm一起以1:5的e:t比率在37℃下在96孔板中共培养1小时。然后在室温下用抗f4/80-藻蓝蛋白标记bmdm持续15分钟，并用pbs洗涤两次。将板置于冰上，刮取孔以收集bmdm，并使用facscalibur(bd)通过流式细胞仪评估吞噬作用，以确定f4/80+细胞群中f4/80+cfse+细胞的百分比。
为了确定抗体是否具有免疫刺激作用，可以使用体外激动作用测定。对于这种测定，可以使用以下通用方法。在37℃下在5％co2中在补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺(2mm)、丙酮酸(1mm)、青霉素和链霉素(100iu/ml)的rpmi1640培养基(gibcotm)中进行细胞培养。用2mm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记新鲜的pbmc。然后，如等人(51)所述，在24孔板中以1x107细胞/ml的浓度培养pbmc持续48小时，然后进行mab刺激测定。对于pbmc刺激，用含有0.01μg/mlokt3抗体(内部)的pbs将圆底96孔板湿涂持续4小时，然后弃去多余的抗体，并用pbs洗涤板。将每孔1x105pbmc转移到板上，并用5μg/ml的测试mab进行刺激。在刺激后的第4天或第5天，用抗cd8-apc(biolegend)和抗cd4-pe(内部)标记细胞，并通过在facscalibur(bd生物科学公司(bdbiosciences)上进行cfse稀释来评估增殖。
并且为了确定treg缺失性抗体和免疫刺激性抗体的依次治疗是否导致治疗活性改善，可以使用带有肿瘤并表达激活性和抑制性fcγ受体的免疫能力强的动物的体内测定。对于这种测定，可以使用以下实施例中所述的一种，例如，如图1a和4c所示。
如本文所使用的，术语“免疫刺激性抗体(immunostimulatoryantibody或immunostimulatingantibody)”是指在施用于受试者(如人)时特异性结合于存在于效应t细胞表面上的靶标的抗体。免疫刺激性抗体与靶标的结合可以直接通过激动作用(例如，针对tnf超家族激动剂受体的抗体，如抗4-1bb、ox40抗体)或间接通过抑制信号的阻断(例如通过抑制抗体对pd1/pdl1轴的阻断)通过刺激效应t细胞来导致对免疫应答的刺激。这种效应t细胞可以是cd8+细胞；在此类实施方案中，免疫刺激性抗体是cd8激活性和/或cd8增强性抗体。另外或可替代地，这种效应t细胞可以是cd4+细胞；在此类实施方案中，免疫刺激性抗体是cd4激活性和/或cd4增强性抗体。
我们在本文中表明，以fc:fcγr依赖性或非依赖性方式起作用的针对不同靶标的具有免疫刺激或共抑制性质的抗体可用于免疫刺激。免疫刺激性抗体可以是以fc:fcγr依赖性方式激动在效应t细胞上表达的免疫刺激性受体(如4-1bb)的抗体，也可以是以fc:fcγr非依赖性方式拮抗在效应t细胞上表达的免疫检查点受体(如pd-1)的抗体。
为了确定抗体是否为本发明意义上的免疫刺激性抗体，可以使用显示出响应于mab的t细胞增殖的体外测定法。上述测定可用于此目的。
为了确定抗体是否缺乏treg消耗作用或是否具有差的treg消耗作用，可以使用体外吞噬作用测定法或体内消耗研究。实施例中描述的测定可用于此目的。例如，测试小鼠组在第0天接受肿瘤。当可触知肿瘤时(或在肿瘤模型的适当阶段)，向小鼠静脉注射mab，然后每隔一天施用另外3次腹腔注射(最终剂量为200μg，或按照mab确定)。然后在最后一次mab施用后1或2天杀死小鼠，并通过流式细胞仪分析脾脏和肿瘤的til含量，以及肿瘤和脾脏(对照组织)中cd4+群体内的foxp3+细胞的频率。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体是人抗体。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人抗体。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人源化抗体。
如上所述，由于可以通过修饰抗体的其它部分来调节消耗/免疫刺激作用，因此根据本发明以组合形式使用的treg消耗性抗体和免疫刺激性抗体可以均包含相同的cdr。
例如，可以通过使用人igg1抗体形式的抗体来获得treg消耗性抗体；因此，在一些实施方案中，treg消耗性抗体是人igg1抗体。也可以通过使用表现出与一个或几个激活性fc受体的结合改善和/或经工程改造以改善与一个或几个激活性fc受体的结合的人igg1抗体形式的抗体来获得treg消耗性抗体；因此，在一些实施方案中，treg消耗性抗体是fc经工程改造的人igg1抗体。也可以通过使用鼠igg2a抗体或人源化的鼠igg2a抗体来获得treg消耗性抗体，并且相应地，在一些实施方案中，treg消耗性抗体是人源化的鼠igg2a抗体。
此外，可以通过使用人igg2抗体(如人igg2b抗体)形式的抗体或人igg4抗体形式的抗体来获得免疫刺激性抗体。因此，在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人igg2抗体。在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人igg2b抗体。在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人igg4抗体。也可以通过使用鼠igg1抗体或人源化的鼠igg1抗体来获得免疫刺激性抗体，并且在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是人源化的鼠igg1抗体。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是与激活性fcγ受体相比，对抑制性fcγ受体表现出增强的结合的抗体。在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是与激活性fcγ受体相比，对人fcγriib表现出增强的结合的抗体。
在一些实施方案中，对免疫刺激性抗体进行工程改造，从而使得与激活性fcγ受体相比，所述免疫刺激性抗体对抑制性fcγ受体具有增强的结合。在一些实施方案中，对免疫刺激性抗体进行工程改造，从而使得与激活性fcγ受体相比，所述免疫刺激性抗体对人fcγriib具有增强的结合。
本发明的treg消耗性抗体或根据本发明使用的treg消耗性抗体所结合的靶标可以选自由属于tnfrs的靶标组成的组。属于tnfrs的靶标可以选自由4-1bb、ox40和tnfr2组成的组。
可替代地，本发明的treg消耗性抗体或根据本发明使用的treg消耗性抗体所结合的靶标可以选自由icos、gitr、ctla-4、cd25和神经纤毛蛋白-1组成的组。在一些实施方案中，靶标不是cd25。
本发明的免疫刺激性抗体或根据本发明使用的免疫刺激性抗体所结合的靶标可以选自由4-1bb和ox40组成的组。
可替代地，本发明的免疫刺激性抗体或根据本发明使用的treg消耗性抗体所结合的靶标可以选自由icos、gitr、ctla-4、tnfr2、cd25和pd-1组成的组。在一些实施方案中，靶标不是cd25。
在本发明的一些实施方案中，至少一个靶标是4-1bb，其也被表示为cd137和肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)。4-1bb在cd4+和cd8+t细胞激活后在treg上表达，并且其连接是针对小鼠抗病毒和b细胞淋巴瘤的最佳保护性cd8t细胞应答所必需的(11、12)。抗4-1bb特异性抗体在体外增强抗原刺激的t细胞的增殖和存活，与抗cd40相似，抗4-1bbmab在很大程度上依赖于cd8t细胞的临床前癌症模型中促进抗肿瘤免疫力(12、13)。4-1bb是定义treg谱系的转录因子foxp3的下游靶标，其在静止的treg细胞上表达并在treg激活时上调(14、15)，因此抗4-1bb可能可以通过treg细胞的消耗发挥部分作用。抗4-1bb抗体是消耗性抗体还是刺激性抗体可能取决于其fcγr的用法，并且在导致本发明的工作中，发明人进行了体外和体内实验以探索肿瘤环境中治疗性抗4-1bbmab的最佳同种型。
我们发现，尽管与具有相同特异性的migg2a版本相比，migg1同种型mab表现出优异的激动活性和对cd8+t细胞的直接免疫刺激作用，但在已建立的实体瘤环境中，migg2amab提供了最佳的治疗活性。我们发现，migg2amab的效力归因于肿瘤内treg消耗。然而，当消耗被阻止时，在缺乏激活性fcγr的小鼠中，migg2a的治疗潜力得以保留。在这些条件下，通过结合抑制性fcγriib将migg2a转化为激动剂。除此之外，我们确定消耗和激动作用是竞争性机制，同时参与这两种机制会导致功效降低。可以通过依次施用treg消耗性同种型和免疫刺激性同种型或通过对fc进行工程改造以产生双重活性的抗4-1bbmab(具有最佳的fcγr消耗能力以及fcγr非依赖性激动作用)来克服这种钝化。总之，这些结果表明，具有相同靶标特异性的免疫调节性mab可以利用不同的机制来介导治疗，并且其最佳使用取决于肿瘤微环境中的同种型、局部fcγr组库、免疫抑制细胞和效应细胞的丰度和功能及其对靶标的相对和绝对表达。重要的是，我们的研究结果进一步表明，可以通过互补但相互竞争的作用机制暂时施用免疫调节性mab来优化结果，并且进一步可以通过mab工程化产生能够利用多种机制的单一药剂以提高治疗效果。这些结果对现有和正在开发的免疫调节性mab的施用以及下一代免疫调节性抗体的设计具有影响。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自下表1所示的组的抗4-1bb抗体分子。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含cdr中的1-6个的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述cdr来自选自以下的每个组：seqid.no:1-6；seqid.no:9-14；seqid.no:17-22；seqid.no:25-30；seqid.no:33-38；seqid.no:41-46；seqid.no:49-54；seqid.no:57-62；seqid.no:65-70；seqid.no:153-158和seqid.no:163-168。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含选自以下的6个cdr的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子：seqid.no:1-6；seqid.no:9-14；seqid.no:17-22；seqid.no:25-30；seqid.no:33-38；seqid.no:41-46；seqid.no:49-54；seqid.no:57-62；seqid.no:65-70；seqid.no:153-158和seqid.no:163-168。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含vh的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seqid.no:7、15、23、31、39、47、55、63、71、159、161和169。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含vl的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seqid.no:8、16、24、32、40、48、56、64、72、160、162和170。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含vh和vl的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述vh和vl选自由以下组成的组：seqid.no:7-8、15-16、23-24、31-32、39-40、47-48、55-56、63-64、71-72、159-160、161-162和169-170。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自下表1所示的组的抗4-1bb抗体分子。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含cdr中的1-6个的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述cdr来自以下每个组：seqid.no:1-6；seqid.no:9-14；seqid.no:17-22；seqid.no:25-30；seqid.no:33-38；seqid.no:41-46；seqid.no:49-54；seqid.no:57-62；seqid.no:65-70；seqid.no:153-158和seqid.no:163-168。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含选自以下的6个cdr的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子：seqid.no:1-6；seqid.no:9-14；seqid.no:17-22；seqid.no:25-30；seqid.no:33-38；seqid.no:41-46；seqid.no:49-54；seqid.no:57-62；seqid.no:65-70、153-158和seqid.no:163-168。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vh的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seqid.no:7、15、23、31、39、47、55、63、71、159、161和169。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vl的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seqid.no:8、16、24、32、40、48、56、64、72、160、162和170。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vh和vl的抗体分子组成的组的抗4-1bb抗体，所述vh和vl选自由以下组成的组：seqid.no:7-8、15-16、23-24、31-32、39-40、47-48、55-56、63-64、71-72、159-160、161-162和169-170。
表1：4-1bb抗体
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自下表2所示的组的抗ox40抗体分子。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含cdr中的1-6个的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述cdr来自选自以下的每个组：seqid.no:73-78；seqid.no:81-86；seqid.no:89-94；seqid.no:97-102；seqid.no:105-110；seqid.no:113-118；seqid.no:121-126；seqid.no:129-134；seqid.no:137-142；seqid.no:145-150和seqid.no:171-176。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含6个cdr的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述6个cdr来自选自以下的每个组：seqid.no:73-78；seqid.no:81-86；seqid.no:89-94；seqid.no:97-102；seqid.no:105-110；seqid.no:113-118；seqid.no:121-126；seqid.no:129-134；seqid.no:137-142；seqid.no:145-150和seqid.no:171-176。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自包含vh的组的抗ox40抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seqid.no:79、87、95、103、111、119、127、135、143、151和177。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含vl的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seqid.no:80、88、96、104、112、120、128、136、144、152和178。
在一些实施方案中，treg消耗性抗体分子是选自由包含vh和vl的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述vh和vl选自由以下组成的组：seqid.no:79-80、87-88、95-96、103-104、111-112、119-120、127-128、135-136、143-144、151-152和177-178。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自下表2所示的组的抗ox40抗体分子。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含cdr中的1-6个的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述cdr来自选自以下的每个组：seqid.no:73-78；seqid.no:81-86；seqid.no:89-94；seqid.no:97-102；seqid.no:105-110；seqid.no:113-118；seqid.no:121-126；seqid.no:129-134；seqid.no:137-142；seqid.no:145-150和seqid.no:171-176。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含选自以下的6个cdr的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子：seqid.no:73-78；seqid.no:81-86；seqid.no:89-94；seqid.no:97-102；seqid.no:105-110；seqid.no:113-118；seqid.no:121-126；seqid.no:129-134；seqid.no:137-142、145-150和seqid.no:171-176。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vh的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seqid.no:79、87、95、103、111、119、127、135、143、151和177。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vl的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seqid.no:80、88、96、104、112、120、128、136、144、152和178。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体分子是选自由包含vh和vl的抗体分子组成的组的抗ox40抗体分子，所述vh和vl选自由以下组成的组：seqid.no:79-80、87-88、95-96、103-104、111-112、119-120、127-128、135-136、143-144、151-152和177-178。
表2：ox40抗体
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是抗pd1抗体，优选为人抗pd1抗体。抗pd1抗体可以选自由纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)组成的组。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是抗pd1抗体，优选为人抗pd1抗体。抗pd1抗体可以选自由纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)组成的组。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是抗pdl1抗体，优选为人抗pdl1抗体。抗pdl1抗体可以是阿特珠单抗(atezolizumab)。
在一些实施方案中，免疫刺激性抗体是抗ctla-4抗体，优选为人抗ctla-4抗体。抗ctla-4抗体可以选自由伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremilimumab)组成的组。
在施用免疫刺激性抗体之前，将treg消耗性抗体施用给受试者，如人。这意味着首先将treg消耗性抗体施用于肿瘤，从而达到treg消耗作用。一旦显示出treg消耗作用，就施用免疫刺激性抗体。可以通过暂时分离两种抗体来实现这种依次施用。可替代地，或结合第一选项，依次施用也可以通过以下实现：两种抗体的空间分离；以某种方式(如肿瘤内)施用treg消耗性抗体使其在免疫刺激性抗体之前到达肿瘤，所述免疫刺激性抗体稍后以某种方式(如全身性)施用，从而使其在treg消耗性抗体之后到达肿瘤。
医学领域的技术人员将了解，可以用不同的添加剂来修改药物，以例如改变药物被人体吸收的速率；并且可以以不同的形式修改药物，以例如允许特定的身体施用途径。
因此，我们包含了：本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物可以与赋形剂和/或药学上可接受的载剂和/或药学上可接受的稀释剂和/或佐剂组合。
我们还包含，本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物可以适合于肠胃外施用，本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物包含：水性和/或非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂和/或缓冲剂和/或抑菌剂和/或使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和/或增稠剂。本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物可以存在于单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿瓶和小瓶)中，并且可以储存在仅需要在使用之前添加无菌液体载剂(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。
可以由前述种类的无菌粉末和/或颗粒和/或片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
对于人类患者的肠胃外施用而言，单次或分次施用的treg消耗性抗体和/或免疫刺激性抗体的每日剂量水平通常为1mg/kg患者体重到20mg/kg，或者在一些情况下甚至高达100mg/kg。在特殊情况下，例如结合长期施用时，可以使用较低的剂量。在任何情况下，医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且所述实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是一般情况的示例。当然，在个别情况下，应使用更高或更低的剂量范围，并且这些剂量范围处于本发明的范围内。
通常，本发明的组合物和/或药物将含有浓度介于约2mg/ml到150mg/ml之间或介于约2mg/ml到200mg/ml之间的treg消耗性抗体和/或免疫刺激性抗体。在优选的实施方案中，本发明的药物和/或组合物将含有浓度为10mg/ml的treg消耗性抗体和/或免疫刺激性抗体。
通常，在人类中，口服或肠胃外施用本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物是最方便的优选途径。对于兽医学用途，根据正常兽医学实践将本发明的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物作为适当可接受的调配物施用，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了一种药学调配物，其包含一定量的可有效治疗各种病症的本发明的抗体和/或药剂(如上所述和下文进一步描述的)。优选地，所述组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物适于通过选自包括以下的组的途径进行递送：静脉内；肌肉内；皮下。
本发明还包含包含本发明的多肽结合部分的药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐的组合物和/或抗体和/或药剂和/或药物。用于制备可用于本发明的上述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐，等等。也可以使用药学上可接受的碱加成盐来产生根据本发明所述的药剂的药学上可接受的盐形式。可用作试剂以制备本发明药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的化学碱，所述碱盐本质上是酸性的。此类无毒碱盐包含但不限于：衍生自此类药学上可接受的阳离子的碱盐，如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的碱盐；铵或水溶性胺加成盐，如n-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐，等等。可以将本发明的药剂和/或多肽结合部分冻干以用于储存，并在使用前在合适的载剂中重构。可以使用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、饼干燥)和/或重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，对于常规免疫球蛋白，igm抗体往往比igg抗体具有更大的活性损失)，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。在一个实施方案中，当重新水化时，冻干的(冷冻干燥的)多肽结合部分损失其活性(冻干前)的不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。
treg消耗性抗体分子和免疫刺激性抗体分子的组合可以用于癌症治疗，其中在向受试者施用免疫刺激性抗体分子之前向所述受试者施用treg消耗性抗体分子。
我们包含，受试者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，哺乳动物受试者是人类或非哺乳动物，如马、牛、羊、猪、骆驼、狗或猫。最优选地，哺乳动物受试者是人类。
通过“表现”，我们包含了：受试者表现出癌症症状和/或癌症诊断标志物、和/或所述癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量和/或评估和/或量化。
对于医学领域的技术人员而言，容易理解的是：癌症症状和癌症诊断标志物将是什么以及如何测量和/或评估和/或量化癌症症状的严重程度是否降低或增加、或癌症诊断标志物是否减少或增加；以及如何使用这些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌症的预后。
癌症治疗通常作为疗程来进行，也就是说，在一段时间内施用治疗剂。疗程的时间长短取决于许多因素，这些因素可以包含所施用的治疗剂的类型、所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重程度以及受试者的年龄和健康状况，以及其它原因。
通过“在治疗期间”，我们包含了：受试者当前正在接受疗程、和/或正在接受治疗剂、和/或正在接受治疗剂疗程。
在一些实施方案中，根据本发明的待治疗的癌症是实体瘤。
在一些实施方案中，癌症选自由肉瘤、癌和淋巴瘤组成的组。
在一些实施方案中，癌症选自由鳞状细胞癌(scc)、胸腺瘤、神经母细胞瘤或卵巢癌组成的组。
上述癌症中的每一种都是众所周知的，并且症状和癌症诊断标志物以及用于治疗所述癌症的治疗剂也得到了很好的描述。因此，用于治疗上述癌症类型的症状、癌症诊断标志物和治疗剂是医学领域的技术人员已知的。
对大量癌症的诊断、预后和进展的临床定义取决于某些被称为分期的分类。那些分期系统用于核对大量不同的癌症诊断标志物和癌症症状，以提供关于癌症的诊断和/或预后和/或进展的摘要。肿瘤学领域的技术人员将了解如何使用分期系统评估癌症的诊断和/或预后和/或进展，以及应该使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来进行评估。
通过“癌症分期”，我们包含了：rai分期，其包含0期、i期、ii期、iii期和iv期；和/或binet分期，其包含a期、b期和c期；和/或安娜堡(annarbour)分期，其包含i期、ii期、iii期和iv期。
已知的是，癌症可以引起细胞形态异常。这些异常通常可以重复地发生在某些癌症中，这意味着检查这些形态变化(也被称为组织学检查)可用于癌症的诊断或预后。用于使样品可视化以检查细胞形态并制备用于可视化的样品的技术在本领域中是众所周知的；例如，光学显微镜或共聚焦显微镜。
通过“组织学检查”，我们包含了：存在小型成熟淋巴细胞；和/或存在具有狭窄细胞质边界的小型成熟淋巴细胞；存在具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞；和/或存在具有狭窄细胞质边界且具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞；和/或存在非典型细胞和/或裂解的细胞和/或原代淋巴细胞。
众所周知，癌症是细胞dna突变的结果，所述突变可能导致细胞避免细胞死亡或不受控制地增殖。因此，检查这些突变(也被称为细胞遗传学检查)可能是评估癌症诊断和/或预后的有用工具。这方面的一个实例是删除染色体位点13q14.1，这是慢性淋巴细胞性白血病的特征。检查细胞突变的技术在本领域中是众所周知的；例如，荧光原位杂交(fish)。
通过“细胞遗传学检查”，我们包含检查细胞中的dna，并且具体地说，染色体。细胞遗传学检查可以用于鉴定dna的变化，所述变化可能与难治性癌症和/或复发性癌症的存在有关。此类变化可能包含：13号染色体长臂中的缺失；和/或染色体位点13q14.1的缺失；和/或12号染色体的三体性；和/或12号染色体长臂中的缺失；和/或11号染色体长臂中的缺失；和/或11q的缺失；和/或6号染色体长臂中的缺失；和/或6q的缺失；和/或17号染色体短臂中的缺失；和/或17p缺失；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或抗原基因受体重排；和/或bcl2重排；和/或bcl6重排；和/或t(14:18)易位；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或(3:v)易位；和/或(8:14)易位；和/或(8:v)易位；和/或t(11:14)和(q13:q32)易位。
已知的是，患有癌症的受试者表现出某些身体症状，这通常是由于癌症对身体的负担所致。这些症状通常在同一癌症中再次发生，因此可以作为疾病的诊断和/或预后和/或进展的特征。医学领域的技术人员将理解哪些身体症状与哪些癌症相关，以及评估那些身体症状如何与疾病的诊断和/或预后和/或进展相互关联。通过“身体症状”，我们包含肝肿大和/或脾肿大。
附图说明
在下文的实施例中，参考以下附图：
图1.抗4-1bbmigg2amab(而非migg1)在多种癌症模型中均具有生存益处。图1a：在第0天，通过皮下注射5x105ct26对balb/c小鼠组进行刺激。当可触知肿瘤时，向小鼠静脉内注射抗4-1bb(lob12.0)migg1、migg2a或pbs对照，然后每隔一天施用另外3次腹腔注射(最终剂量为200μg)。图1b：通过皮下注射2×106nxs2对a/j小鼠组进行刺激，当可触知肿瘤时，腹腔注射200μg抗4-1bbmab或同种型对照mab。3天后施用200μg第二剂。在这两个实验模型中，均监测肿瘤的生长，并在平均肿瘤面积超过225mm2时将小鼠淘汰。如图所示，数据表示为肿瘤激发后的天数的肿瘤面积(mm2)；每条线代表单个小鼠。右侧图示出了到人道终点的存活百分比。数据表示至少2个独立实验的实施例，其中n＝每组5只小鼠。
图2.抗4-1bbmigg1在体外和体内均发挥激动剂活性。
图2a：如图所示，将被分类为去除gfp+细胞(-treg)或未去除gfp+细胞(+treg)的foxp3-gfp小鼠的脾细胞与0.1μg/ml抗cd3和指示浓度的抗4-1bb(lob12.0)migg1或migg2a一起孵育。在72小时培养的最后16小时期间测量[3h]-胸苷的掺入。图2b：将c57bl/6小鼠的脾细胞与0.1μg/ml抗cd3和指示浓度的抗4-1bbmigg1、migg2a或两者的1:1混合物一起孵育，然后评估[3h]-胸苷的掺入。图2a和图2b中的数据示出了三联孔每分钟的平均值(+/-sem)计数。图2c：在第0天，向小鼠组腹腔注射5mgova和200μg抗4-1bbmigg1或migg2a。通过流式细胞仪量化外周血中的siinfekl特异性t细胞应答，并将其表示为总cd8+细胞的％。数据来自三个单独的实验，并示出了响应的时间过程(平均值±sem，每组6只小鼠)和响应的峰值(平均值和单个响应，每组9只小鼠，*p＝0.023)。图2d：在第0天，通过皮下注射2×106nxs2对a/j小鼠组进行刺激，并且在第3天，腹腔注射200μg抗4-1bbmab或同种型对照mab以及对照(siinfekl；左图)或th(fetfeaki；右图)肽。在第6天施用第二剂mab(200μg)。图2b和图2c中的数据表示至少2个实验的实施例，其中n＝每组5只小鼠。
图3.小鼠和人类肿瘤中的常驻treg细胞优先表达4-1bb。图3a：示出了ct26肿瘤中的4-1bb表达性肿瘤内foxp3+treg的免疫荧光显微镜图像(左图)。比例尺＝50μm。流式细胞直方图显示4-1bb在til和脾细胞的t细胞亚群上的表达(右图)。cd4+foxp3+(顶部小图)、cd4+foxp3-(中间小图)和cd8+t细胞(底部小图)上的4-1bb表达(黑线)与同种型对照(灰线)。从携带ct26肿瘤的小鼠中分离细胞。图3b：从手术患者处获得新鲜切除的卵巢肿瘤、腹水和血液样品，并与健康的pbmc进行比较。将肿瘤样品切碎并消化，然后用密度梯度分离。获得匹配的外周血，并通过离心法分离外周血单核细胞。通过流式细胞仪评估4-1bb在cd4+cd25+cd127-treg细胞、cd4+非treg细胞和cd8+效应t细胞上的表达。上图示出了具有同一患者的肿瘤组织(黑色实线)、血液(灰色虚线)和腹水(黑色虚线)中的4-1bb表达的代表性直方图。同种型对照以灰色实线描绘。下图示出了不同组织样品的t细胞亚群上的4-1bb表达。数据点表示个体患者/供体，健康pbmc的n＝11，腹水的n＝20，肿瘤的n＝9，并且患者血液的n＝5。图3c：从手术患者处获得新鲜切除的皮肤鳞状细胞癌(scc)和正常皮肤的样品。将样品切碎并消化，然后用密度梯度分离。获得匹配的外周血，并通过离心法分离外周血单核细胞。对细胞进行4-1bb染色，并通过流式细胞仪检测染色。上图示出了代表性直方图，其具有示出为空心直方图的4-1bb染色；肿瘤组织(黑色实线)、血液(灰色虚线)、正常皮肤(黑色虚线)和同型对照(灰色实线)。下图示出了不同组织样品的t细胞亚群上的4-1bb表达。数据点表示10位个体患者。
图4.实体瘤中抗4-1bbmab治疗的主要机制取决于抗体同种型和fcγr的可用性。图4a：在第0天，通过皮下注射5x104个ct26细胞对3-4个wt、fcγriibko或γ链kobalb/c小鼠组进行刺激。当可触知肿瘤时，向小鼠静脉内注射抗4-1bbmigg1、migg2a或pbs对照，然后每隔一天施用另外3次腹腔注射(最终剂量为200μg)。在第13天处死小鼠，并通过流式细胞仪分析脾脏和肿瘤。数据示出了肿瘤(左图)或匹配的脾脏(右图)中cd4+群体内的foxp3+细胞的频率。数据表示两个独立实验。图4b：如(a)所述处理小鼠，列举cd8+、ki67+t细胞，并以与对照相比的倍数变化进行绘制。图4c：用5x104个ct26细胞对wt、γ链ko或fcγr无效小鼠(γ链koxfcγriibko)、γ链ko或fcγriibkobalb/c小鼠组进行刺激，并如(a)所述用抗4-1bbmab进行处理。监测肿瘤的生长，并在平均肿瘤面积超过225mm2时将小鼠淘汰。如图所示，数据表示为肿瘤激发后的天数的肿瘤面积(mm2)，每条线代表单个小鼠。右侧图示出了到人道终点的存活百分比。数据表示至少2个实验的实施例，其中n＝每组5只小鼠。图4d：将用抗4-1bbmigg1、migg2a或对照mab调理过的cfse标记的靶鼠脾t细胞与野生型(实心条)或fcgriibko(空心条)mbmdm共培养，然后评估吞噬作用。(e)(左图)将用抗人4-1bbhigg1mab克隆sap3-6、bi5-b02(也表示为005-bi02)或对照调理过的cfse标记的靶人t细胞与hmdm共培养，然后评估adcp。(右图)通过流式细胞仪测定的与4-1bb表达水平相对绘制的吞噬度水平。在所有情况下，吞噬作用均被绘制为双阳性巨噬细胞的％。
图5.不同抗4-1bb的定期施用或与抗pd-1mab的定期组合增强抗肿瘤活性。图5a：在第0天，通过皮下注射5x104个ct26对年龄和性别匹配的balb/c小鼠组进行刺激。当可触知肿瘤时，向小鼠静脉内注射抗4-1bb(lob12.0)migg1、migg2a、migg1和migg2a两者或pbs对照，然后每隔一天施用另外3次腹腔注射(最终剂量为200μg)。对于定期施用，静脉注射migg2a，然后在4天后腹腔注射migg1。监测肿瘤的生长，并在平均肿瘤面积超过225mm2时将小鼠淘汰。如图所示，数据表示为肿瘤激发后的天数的平均肿瘤面积(mm2)。给出的数据来自两个独立的实验，其中n＝每组10只小鼠。图5b：用ct26肿瘤刺激小鼠，然后如图5a所示进行单一疗法或抗4-1bbmigg1或migg2a和/或抗pd-1rigg1(wt)或其去糖基化形式的预定组合。对于组合，当首先可触知肿瘤时，静脉内施用抗4-1bbmab，然后在4天后腹腔注射抗pd-1。监测肿瘤的生长并如图5a所示绘制数据。数据表示至少2个独立实验的实施例，其中n＝每组4或5只小鼠。图6.经fc工程改造的抗4-1bbmigg2a/h2b具有双重活性并提供增强的癌症治疗。图6a：抗4-1bb(lob12.0)migg2a、migg2a/h2和“偏斜的”migg2a/h2b的nrce-sds曲线。图6b：如图所示，将来自c57bl/6小鼠的脾细胞与0.01μg/ml抗cd3和指示浓度的抗4-1bbmigg1、migg2a或migg2a/h2b一起孵育。在72小时培养的最后16小时期间测量[3h]-胸苷的掺入。图6c：将用抗4-1bbmigg2a、migg2a/h2b或对照mab调理过的cfse标记的靶鼠脾t细胞与野生型mbmdm共培养，然后评估吞噬作用。吞噬作用均被绘制为双阳性巨噬细胞的％。图6d：在第0天，通过皮下注射5x105个eg7对年龄和性别匹配的c57bl/6小鼠组进行刺激。在第3天、第5天和第7天，向小鼠腹腔注射200μgmab或pbs对照，如图所示。在第20天，收获肿瘤，并通过流式细胞仪列举til。n＝每组4只小鼠。(e)如(d)所述设置小鼠并监测肿瘤的生长，并在平均肿瘤面积超过400mm2时将小鼠淘汰。数据表示至少2个独立实验的实施例，其中n＝每组5只小鼠。
图7.抗4-1bbmab表征。图7a：与小鼠fcγri、iib、iii和iv结合的抗4-1bb(克隆lob12.0)migg1、migg2a和亲本rigg2a的表面等离子体共振分析。使重组的可溶性fcγr蛋白(0、6、23、94、375、1500nm)通过以5000ru固定的4-1-bbmab。示出了传感图。图7b：将使用对鼠4-1bb细胞外和跨膜区进行编码的构建体稳定转染的人细胞系与migg1、migg2a同种型的抗4-1bb或与亲本rigg2amab一起在一定浓度范围内孵育，然后用pe标记的二抗进行染色。数据示出了每种浓度下的平均荧光强度，以最大值的百分比表示。图7c：将大鼠抗4-1bb与小鼠migg1或migg2a抗4-1bbmab以指示的浓度进行混合，然后与鼠4-1bb转染的细胞系一起孵育。用抗大鼠二抗检测大鼠mab结合，并且数据表示为相对于竞争性小鼠抗4-1bb浓度的大鼠抗4-1bb抗体的平均荧光强度。
图8.抗4-1bbmigg2amab的抗肿瘤功效依赖于cd8+t细胞。相对于在第0天通过皮下注射5x104个ct26细胞进行刺激，在第-1天、第1天和第4天用500μgcd8消耗性抗体对balb/c小鼠组进行处理或不进行处理。在第6天静脉注射抗41bbmigg2amab，并在第8天、第10天和第12天进行腹腔注射，最终总剂量为200μg。记录肿瘤大小，并在平均肿瘤直径达到15mm时将小鼠淘汰。数据示出了肿瘤激发后的所示天数的肿瘤面积(mm2)，其中每条线代表单个小鼠。(n＝5/组)
图9.响应于ova和抗4-1bbmab的ot-i细胞的初级体内扩增。图9a：向3只野生型或fcγriib-/-小鼠组静脉注射2×105个ot-i细胞，然后24小时(第0天)后腹腔注射0.5mgova和200μgmigg1或migg2a抗4-1bb。对照小鼠仅接受ova。采集血液样品以测量在应答过程中循环的siinfekl四聚体+cd8+细胞，以总cd8+细胞的％(平均值±sem)表示。数据表示2个实验。图9b：在第0天向5只c57bl/6小鼠组皮内注射2.5x105个b16/bl6细胞，然后在第3天、第6天和第9天，在相反侧皮内注射1x106个经辐照的fvax细胞。在注射fvax的同时，向小鼠腹腔注射pbs、100μg抗ctla-4(克隆9d9)或抗ctla-4和300μg抗4-1bb抗体。示出了到人道终点的存活百分比。
图10.抗pd-1mab表征。图10a：与小鼠fcγri、iib、iii和iv结合的抗pd-1(克隆ew1-9)rigg1(黑色实线)和去糖基化的rigg1(灰色实线)的表面等离子体共振分析。使pd-1mab(500nm)通过捕获到具有抗组氨酸mab(gehealthcare)的cm5芯片上的重组的fcγr-his蛋白(1000ru)(r&d系统公司(r&dsystems))。示出了减去0nm曲线的传感图。图10b：分析表明抗pd-1mab与pd-1结合并阻断pd-l1结合。使抗pd-1rigg1(黑色实线)、去糖基化的rigg1(灰色实线)或缓冲液(黑色虚线)通过捕获到具有抗组氨酸mab的cm5芯片上的重组的pd-1-his(r&d系统公司)(2000ru)。在箭头指示的时间点，使重组的pd-l1-fc(r&d系统公司)通过，以证明与pd-1结合并被抗pd-1阻断。
图11.抗4-1bbmigg2a/h2bfcγr结合。与小鼠fcγri、iib、iii和iv结合的抗4-1bb(克隆lob12.0)migg2a和migg2a/h2b的表面等离子体共振分析。使重组的可溶性fcγr蛋白(0、6、23、94、375、1500nm)通过以5000ru固定的4-1bbmab。示出了传感图。
图12示出了hdlm2细胞的结合滴定曲线。
图13示出了配体阻断。
图14示出了体外测定的结果，左侧为4-1bb+ivacd4的adcc，右侧为cd8t细胞增殖。
图15示出了与体外激活的人cd4+细胞的结合。
图16示出了cyon对激活的cd4+t细胞的交叉反应性。
图17示出了配体阻断。
图18示出了对t细胞的adcc，并证明了几种mab对ox40表达性cd4+t细胞诱导了明显的adcc。图示出了5个实验的平均值。campath用作阳性对照而yervoy用作比较剂。
图19示出了体外增殖测定的结果。
图20示出了使用hox40ki/ot1转移模型对不同抗体的体内激动活性。
图21示出了一个表，其总结了本文所描述的抗体中的一些抗体的特性。
图22示出了来自人类不同区室的treg细胞和效应细胞，并证明了肿瘤组织中和/或肿瘤组织附近的treg与外周treg相比具有明显不同的潜在靶标表达曲线。
图23示出了来自小鼠不同器官的treg细胞上的受体表达。
图24示出了与小鼠中的其它细胞类型相比，treg细胞上的受体表达。
实施例
现在将描述体现本发明的某些方面的具体的非限制性实施例。
关于依次施用的实施例
结果
抗4-1bbmab的治疗活性由同种型决定
我们和其它人先前已经确定了靶向tnfr超家族成员的免疫刺激性mab活性对抑制性fcγriib提供的交联的依赖性。为了确定此要求是否类似地适用于抗4-1bb，我们生成了rigg2a抗4-1bbmab的migg1和migg2a嵌合版本(内部生成的lob12.0(16))，如先前针对其它mab特异性所述(17-19)。对lob12.0migg1重链进行编码的核苷酸序列示于seq.id.no:179中，而相应的氨基酸序列示于seqidno:180中。对lob12.0migg2a重链进行编码的核苷酸序列示于seq.id.no:181中，而相应的氨基酸序列示于seqidno:182中。通过表面等离子体共振和流式细胞仪进行的分析表明，这些mab具有预期的mfcγr结合曲线，其中migg2a具有高的抑制性fcγr激活比率(a:i)，而migg1具有低的a:i(图7a，(19、20))；两种mab均保留了等效的4-1bb特异性和结合(图7b和7c)。然后，我们使用ct26结肠癌(图1a)和nxs2神经母细胞瘤(图1b)评估了这些小鼠抗4-1bbmab在三种不同的已建立的实体瘤模型中的治疗潜力。与我们使用抗cd40的研究(18、19、21)和已发表的使用靶向dr5的其它激动性抗tnfr超家族mab的报道(22、23)形成鲜明对比，对于抗4-1bb，高a:i比的migg2amab具有可观的治疗益处(在所有模型中，长期存活率均为80％)，而低a:i比的migg1版本在很大程度上无效(0-20％存活率)。值得注意的是，尽管migg2amab在这些环境中具有保护作用，但其治疗效果仍取决于cd8+t细胞(图8)，并导致长期的生产性抗肿瘤免疫力，如通过肿瘤再激发实验所确定的。这些结果表明，migg2a抗4-1bb的保护作用是通过适应性抗肿瘤免疫应答介导的，但是与抗cd40mab相比，这种mab利用以fcγriib非依赖性方式发生的分子机制。
小鼠igg1同种型的抗4-1bb的免疫刺激活性最佳
鉴于在我们的肿瘤模型和先前研究中获得的结果表明cd8+t细胞在介导抗4-1bbmab的作用中起关键作用，我们试图确定抗4-1bbmab活性对体内和体外t细胞种群的同种型依赖性。使用体外t细胞共刺激测定法(图2a)，仅migg1表现出激动活性，而migg2a(与上文使用的抗体相同)无激动活性。这与其它已发表的结果(18、19)一致。在t细胞培养测定中，migg1的共刺激活性独立于treg细胞，这表明这种抗4-1bbmab通过靶向效应t细胞上的4-1bb来介导其作用。最后，通过添加migg2a消除了migg1的共刺激活性，这表明两种mab变体均以相似的亲和力结合并争相与效应t细胞上的4-1bb结合(图2b)。使用体内免疫模型验证了这些体外结果，在所述模型中，模型抗原ova处于内源性环境(图2c)和ot1t细胞转移环境(图8a)中。在这种情况下，migg1的优异的激动活性依赖于抑制性fcγriib(图2c、图9a)，如先前针对抗cd40mab所示(18、19、24、25)。最后，在两个免疫模型(nxs2肽和b16-sflt3l-ig；分别为图2d和图9b)中，migg1和migg2a同种型抗体具有相同的治疗效果(图2d和图9b)。值得注意的是，在没有接种疫苗的情况下，migg1(而非igg2a)的作用被消除，这证实了migg1(而非migg2a)的运转是通过依赖于免疫激活的机制进行的，并且可能依赖于fcγriib交联(图2d)。
在小鼠肿瘤模型和人类癌症患者中，4-1bb在肿瘤内treg细胞上表达已经确定抗4-1bbmigg2a在治疗具有已建立的肿瘤的小鼠方面比migg1更具活性，但是在这些小鼠中，migg2a缺乏传递共刺激活性的能力，因此我们寻找可以解释其免疫调节作用的替代性机制。与静息效应t细胞相比，4-1bbmrna和蛋白在treg细胞中优先表达(14、26、27)，在treg细胞激活后其表达被进一步上调(27、28)，并且最近已经显示所述表达在人类实体癌的肿瘤内treg中被上调(至少在转录水平上)(29、30)。因此，我们检查了具有高a:ifcγr结合曲线的抗4-1bbmigg2a可以通过删除treg细胞来增强抗肿瘤应答的可能性。我们首先确认了两种鼠类肿瘤模型ct26(图3a)和nxs2中treg细胞上是否存在4-1bb，并且发现4-1bb在相当一部分肿瘤浸润性treg上表达，而仅在一小部分效应t细胞上表达。此外，脾脏treg细胞中只有一小部分表达4-1bb。为了证实这些观察结果在蛋白质水平上对人类可能是可翻译的，我们通过流式细胞仪确定了卵巢癌和鳞状细胞癌患者的肿瘤内treg上是否存在4-1bb。从图3b和图3c中可以看出，在肿瘤的cd4+foxp3+treg细胞上发现4-1bb而在肿瘤的效应cd4+或cd8+t细胞上未发现4-1bb，并且4-1bb在从健康的pbmc、相配的血液、腹水或正常皮肤中分离的treg上的表达水平较低。
fcγr在介导抗4-1bbmab的抗肿瘤活性中的作用
已经确定肿瘤内treg表达4-1bb，因此我们使用ct26肿瘤模型来确定抗4-1bbmab的潜在作用和相对消耗能力。我们的数据表明，在野生型小鼠中，migg2amab有效删除了肿瘤内treg，而migg1变体无效(与上文使用的抗体相同(图4a)。这种消耗作用仅限于肿瘤并取决于共同γ链—激活性fcγr复合物的关键组分—的表达。此外，在fcγriib基因敲除小鼠中，migg1mab的消耗活性提高到与migg2a的消耗活性相似的水平，这表明这些mab的消耗效率与其fcγr的a:i比密切相关，并且可以通过改变fcγr表达来控制消耗效力。接下来，我们试图确定在这些小鼠中是否能观察到肿瘤浸润性cd8t细胞的激活，并且观察到尽管migg1mab在携带wt肿瘤的小鼠中缺乏功效，但如ki-67阳性所监测到的，施用抗4-1bbmigg1mab会导致cd8t的细胞增殖明显增加(图4b)。虽然migg2a同种型也诱导了cd8激活的增加，但这明显小于migg1。这些数据可能证明了treg在ct26肿瘤模型中的主导作用，并表明在不去除treg抑制的情况下，在野生型小鼠中用migg1诱导cd8应答不足以诱导生产性抗肿瘤应答。
由于抗4-1bbmigg2a以依赖于激活性fcγr的表达的方式有效介导肿瘤内treg细胞的消耗，因此我们认为缺少激活性fcγr会对这种mab的治疗作用产生不利影响。然而，令人惊讶的是，在ct26肿瘤模型(图4c)中，在不存在激活性fcγr的情况下，抗4-1bbmigg2a仍保留了抗肿瘤活性，这表明treg细胞消耗可能无法完全说明其治疗活性。与抗4-1bbmigg2a功效的最小作用相反，在不存在激活性fcγr的情况下，抗4-1bbmigg1促进抗肿瘤免疫的能力得到了实质性改善(ct26中为2/5)。鉴于针对migg1和migg2amab表现出的fcγr结合曲线(图7)，这些发现表明，在不存在mab与激活性fcγr竞争性结合的情况下，migg1和migg2a均能有效地结合fcγriib，从而允许mab的最佳交联提供共刺激。在ova模型(图2c)中，在fcrgko动物中观察到的migg2a的t细胞激活进一步支持了这一观点。当在fcγriibko小鼠中进行治疗时，与migg1在fcγriibko小鼠中的增强的treg消耗活性(图4a)一致，migg1同种型mab表现出增强的且与migg2a等效的活性。这些结果与以下观察结果相结合：在不存在所有fcγr的情况下，两种mab均未产生任何治疗活性(图4c)，这证实了有效的非竞争性fcγr结合对于最佳体内活性的重要性。
接下来，我们试图在体外使用小鼠和人类靶标以及效应子来正式证明抗4-1bbmab的消耗能力。使用wt小鼠骨髓衍生的巨噬细胞和4-1bb表达性t细胞靶标，我们观察到migg2a诱导靶细胞的有效吞噬作用，而migg1mab无效(图4d)。与我们的体内消耗结果(图4b)和治疗应答(图4c)一致，当使用fcγriibko巨噬细胞作为效应子时，观察到migg1介导的吞噬作用显著增加，与使用migg2a和wt效应子获得的水平一致。然后，我们使用人靶标和单核细胞衍生的巨噬细胞效应子在完整人系统中证实了我们的发现中的翻译潜力。在这个系统中，我们发现两个不同的huigg1抗人4-1bb克隆(sap3-6和005-b02)可以介导有效的吞噬清除作用(图4e)。最后，我们试图确认消耗的功效由4-1bb表达的水平而不是细胞类型本身决定。我们使用人(图4e)和小鼠(数据未示出)体外生成的具有不同4-1bb表达水平的巨噬细胞和靶细胞进行了此项操作，并发现4-1bb表达与靶细胞消耗效率之间存在直接关联。这支持了以下观点：在肿瘤微环境中，treg上的高水平的4-1bb表达使其成为良好的靶标，而低表达性cd8细胞则可能幸免。
定期施用treg消耗性和免疫调节性mab导致增强的抗癌治疗
我们的结果表明，抗4-bbmab的同种型变体的治疗活性通过不同的机制发生，这表明组合使用可能会增强治疗效果。然而，由于treg细胞(migg2a)的消耗和共刺激细胞(migg1)的传递都依赖于fcγr的参与，而且似乎是以竞争性方式进行的，因此我们推测依次施用相对于同时施用可能是最佳的。因此，我们比较了同时施用和依次施用抗4-1bbmigg2a和migg1mab后的治疗效果。(与上文使用的抗体相同)如先前观察到的，migg2a(而不是migg1)变体作为单一药剂具有活性。与migg2a单一药剂治疗相比，同时施用migg2a和migg1抗4-1bbmab导致治疗效果降低，如肿瘤大小增加(图5a)和无肿瘤小鼠数量减少(图5b)所指示的。与之形成鲜明对比的是，与单独用任一抗体变体进行的单一药剂治疗相比，先递送第一个migg2a以删除treg细胞然后递送激动性migg1以提供共刺激，既可以改善肿瘤生长抑制作用又可以增加无肿瘤小鼠的数量(图5a和b)。这些发现表明，可以通过依次施用来优化fcγr依赖性免疫调节性mab的治疗功效。重要的是，我们的发现还表明，treg消耗可能具有广泛的用途，尤其是在以fcgr非竞争性方式使用时，改善抗4-1bb以外的免疫刺激性抗体。
因此，接下来我们研究了将treg消耗性抗4-1bb与经过临床验证的免疫激动剂抗pd1组合的治疗潜力。我们降低了mab的剂量以获得次优的单一疗法，然后依次将同种型最佳抗4-1bbmigg2a与fcγr无效结合的去糖基化(31)变体抗pd-1阻断抗体(图10a和10b)相结合，从而模拟经临床验证的抗pd-1抗体纳武单抗和派姆单抗的fcγr结合缺乏/不良。与具有20-25％长期应答的单一疗法相比，这种组合产生了治疗的显著增加，从而导致80％的长期应答(图5c)。值得注意的是，mab的次优同种型的组合不会导致任何应答增强，这表明对于最佳组合疗法而言，了解任何组合中每个组分的同种型和排程要求至关重要。
被工程改造为具有双重活性的抗4-1bbmigg2a/h2b提供增强的癌症治疗
已经证明，与通过单独的任一机制相比，通过treg消耗与免疫抑制的激动作用/释放的最佳组合可以实现更好的应答，因此我们试图证明可以通过对单个mab进行工程改造来提供这些多种机制。鉴于我们的观察结果，即mab介导的treg消耗和免疫刺激性激动作用的fcγr要求不同且具有竞争性，我们试图利用我们先前的发现，即人igg2铰链区能够提供具有fcγr非依赖性激动特性的抗tnfr超家族成员mab(25)。在本文中，我们将人igg2区克隆到如前所述的抗4-1bb的鼠migg2a恒定区中(25)，然后将铰链偏斜成激动作用增强的‘b’形，从而制成抗4-1bbmigg2a/h2b(图6a)。对lob12.0mκ进行编码的核苷酸序列示于seq.id.no:183中，而相应的氨基酸序列示于seqidno:184中。对lob12.0huigghinge2.migg2afc(migg2a/h2b)进行编码的核苷酸序列示于seq.id.no:185中，而相应的氨基酸序列示于seqidno:186中。对lob12人κ进行编码的核苷酸序列示于seq.id.no:187中，而相应的氨基酸序列示于seqidno:188中。当对t细胞增殖进行体外测试时，尽管fcγr结合曲线(图11)未改变，但与migg2a亲本相比，migg2a/h2b具有显著增强的激动活性(图6b)。尽管具有这种增强的激动活性，但经过工程改造的mab在使用bmdm和4-1bb表达性靶细胞的体外仍具有很强的吞噬潜力(图6c)，这表明我们在不存在竞争性fcγr要求的情况下产生了既具有激动性潜力又具有消耗性潜力的试剂。最后，我们在eg7肿瘤模型中将这种mab与亲本migg2a进行了比较，并且发现双重活性的migg2a/h2b具有与亲本migg2a相同的有效treg消耗能力，但现在还具有明显的cd8刺激能力，从而导致cd8/treg比率提高(图6d)。与治愈率为60％的标准migg2a相比，这种增强的双重活性的mab还显示出更大的治疗潜力，即治愈100％的经处理的小鼠(图6e)。这些数据首次证明，可以对单个mab进行工程改造以最佳地介导消耗和激动作用，并通过这种增强的双重活性提供更好的治疗。
讨论
已经在多种体外和体内模型中确定，抗tnfr超家族mab需要有效的交联以诱导其激动作用，而对于大多数mab而言，最好通过抑制性fcγr结合来提供这种交联(8、9、18、19、23、32、33)。尽管有这些发现，但仍不清楚这种激动性结合是否是在实体瘤环境中有助于这些mab的治疗活性的主要作用机制。我们使用migg2a和migg1同种型抗4-1bbmab研究了这个问题，它们分别具有高和低的激活性:抑制性fcγr比率，因此分别具有良好的消耗性潜力和激动性潜力(10)。
通过在不同的野生型小鼠品系中使用两种不同的实体瘤模型，我们发现migg2amab产生了实质性的治疗效果，而migg1在很大程度上无效(图1a、图1b)。这些结果与这些mab在cd8+t细胞上的激动活性形成鲜明对比，其中migg1更有效(图2a、图2b和图9a)。与以前的抗cd40mab出版物明显不同的是，抗4-1bbmigg2a在体内并非没有t细胞激动活性，这表明4-1bb可能具有比cd40更低的信号传递交联阈值(18、19)。在这些不同的肿瘤模型中显示的migg2a依赖性治疗活性表明，治疗可能是由效应细胞依赖性消耗作用介导的。所用的肿瘤均不是4-1bb阳性，这意味着它不能像抗cd20mab那样作为直接的肿瘤靶向作用(34)。
鉴于最近的发现，即靶向ctla-4、ox40和gitr的mab能够通过肿瘤内treg消耗来介导治疗(5-7)，我们在这些模型中检查了4-1bb的表达，并且发现4-1bb在肿瘤内treg细胞上特异性上调(图3a)。重要的是，针对这些发现在人类上的潜在翻译，我们发现4-1bb在患有卵巢癌和鳞状细胞癌的患者(分别为图3b和图3c)中均显示出肿瘤内treg细胞上的表达受限，这支持了这种机械学方法在患者中的治疗潜力。此外，migg2a以依赖于激活性fcγr的方式消除了这一抑制群体，而migg1的作用很小(图4a)。与生产性消耗所需的高活性抑制性fcr结合的要求一致，当在fcγriibko中进行这些实验时，小鼠migg1在体内(图4a)和体外(图4d)的消耗能力均变得与migg2a相当。
尽管在这些模型中，treg消耗是4-1bbab最有效的作用机制，但我们推测在不存在与激活性fcγr的竞争性结合的情况下，这些mab可能通过其激动功能发挥治疗作用。我们使用ct26模型测试了这种潜力，并且发现在不存在激活性fcγr的情况下，migg1mab确实具有治疗性(图4c)。同样值得注意的是，与我们的观点一致，即4-1bb在体内的交联阈值相对较低，在不存在激活性fcγr的情况下，migg2a也保留了活性。当在fcγriibko小鼠中进行治疗时，与migg1在fcγriibko小鼠中的增强的treg消耗活性(图4a和图4c)一致，migg1同种型mab表现出增强的且与migg2a等效的活性。此外，在不存在fcγr的情况下，两种mab均不能保护小鼠(图4c)，这表明激动机制和消耗机制两者都依赖于fcγr。
鉴于提供了适当的fcγr，抗4-1bbmab可以使用两种独立的机制发挥治疗作用这一事实表明，如果依次施用mab，则两种机制都可以发挥作用。事实上，当首先施用migg2a以删除treg细胞，然后施用migg1以传递激动信号时便是如此(图5a和图5b)。重要的是，如果同时施用mab，则几乎没有治疗效果。这些观察结果支持以下假设：不可能通过单一抗原的结合同时结合这两种fcγr依赖性机制，但如本文所示，这些mab的时间性分离或潜在的空间(肿瘤内与全身)分离可能有助于它们的组合功效。
为了进一步证明抗4-1bbmab在患者中可能存在的同种型和排程要求，在临床结果表明可能需要组合方法的情况下，我们研究了不同的mab与抗pd-1的组合。在这种环境下，我们发现抗4-1bb和抗pd-1两者的同种型最佳版本产生了显著的组合作用，从而导致治愈80％经处理的小鼠，这与单一疗法的20-25％治愈率和同种型次优组合形成鲜明对比。
在临床上，使用激动性抗体靶向4-1bb引起了很多关注。然而，我们的数据显示，肿瘤位点处的cd8+或cd4+t细胞中只有大约1％的细胞表达4-1bb。此外，最近的发现表明，浸润黑色素瘤患者的肿瘤位点的cd3+cd8+细胞中只有大约10％的细胞表达4-1bb，尽管这些细胞富含肿瘤反应性克隆(35)。因此，我们目前的发现，即抗4-1bb可用于消耗treg从而释放免疫治疗性应答，表明这一策略可能对患者特别有吸引力。使用其它推定的treg消耗性免疫治疗(例如抗ox40和抗ctla-4)进行的临床研究看起来很有希望(5、36、37)，并且进一步证实了treg消耗性抗4-1bbmab在患者中的潜力。
目前正在开发两种完全人源化的抗4-1bbmab；百时美施贵宝(bristol-myerssquibb)生产的igg4抗体urelumab(bms-663513)和辉瑞(pfizer)生产的完全人源化的igg2pf-05082566。迄今为止，已证明pf-05082566是安全的，其仅对患者造成1级毒性(38)，而urelumab对15％的患者造成不良反应，包含肝酶、瘙痒和腹泻增加(39)。尽管它们的安全性有前景，但不能预测urelumab或pf-05082566会与fcγriib强烈结合，这使人们怀疑这两种抗体在患者中是否有效(40)。我们小组的最近数据表明，靶向4-1bb的人igg2抗体可充当独立于fcγr的超激动剂，并且pf-05082566仍可能以类似方式起作用(25)。本文提供的数据显示，与免疫激动剂变体抗4-1bb抗体相比，treg缺失的疗效提高，与cd8效应细胞相比，肿瘤内的4-1bb在treg上选择性表达，这些数据支持被选择用于treg消耗的人治疗性抗4-1bbigg1同种型抗体的开发(40)。最近证实，此类treg缺失性抗体可以协同增强应答，并帮助克服对检查点阻断的抗性(50)。
到目前为止，我们的发现支持以下观点：免疫调节性mab可以利用多种作用机制进行治疗，并且我们考虑了是否可以对单个抗体进行工程改造以最佳地执行消耗和激动作用的可能性。鉴于我们的数据证明了这些机制在体外和体内存在竞争性fcγr要求，由于任何一个mab一次只能结合单个fcγr，因此对mab进行工程改造使其具有增强的激活性和抑制性fcγr结合似乎不太可能。鉴于这些潜在的局限性，我们生成了具有最佳消耗能力的migg2amab来整合被我们偏斜成激动作用最佳的‘b’形的higg2铰链区。我们假设这种mab能够执行两种功能，并且发现在体外(图6b和c)和体内(图6d)都是如此，并且这导致在实体瘤模型中增强治疗(图6e)。这些结果对现有和正在开发的免疫调节性mab的施用以及未来试剂的设计和开发及其使用策略具有直接影响。
序列
seqidno:179—对lob12.0migg1重链进行编码的核苷酸序列。
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seqidno:180—lob12.0migg1重链的氨基酸序列。带下划线的序列表示前导序列。
meiwlslvflvlfikgvqcevqlvesggglvqpgrslklscaasgftfsnfgmawvcqapttglewvatisydgtdsyyrdsvkdrftisrdnakstlylqmdslrsedtaayycvrhedvyygmgyfdhwgqgvlvtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk
seqidno:181—对lob12.0migg2a重链进行编码的核苷酸序列。
aagcttcaggacctcaccatggagatctggctcagcttggttttccttgtccttttcataaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctggtggaggcttagtgcagcctggaaggtccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagtaactttggcatggcctgggtctgccaggctccaacgacggggctggagtgggtcgcaaccattagttatgatggtactgacagttactatcgagactccgtgaaggaccgattcactatctccagagataatgcaaaaagcaccctatacctgcaaatggacagtctgaggtctgaggacacggccgcttattactgtgtaagacatgaggatgtatactacggaatggggtactttgatcactggggccaaggagtactagtcacagtctcctcagccaaaacgacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggttatttccctgagccagtgaccttgacctggaactctggatccctgtccagtggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacaccctcagcagctcagtgactgtaacctcgagcacctggcccagccagtccatcacctgcaatgtggcccacccggcaagcagcaccaaggtggacaagaaaattgagcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatgagaattc
seqidno:182—lob12.0migg2a重链的氨基酸序列。带下划线的序列表示前导序列。
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seqidno:183—对lob12.0mκ进行编码的核苷酸序列。
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