温故知新｜重度子痫前期胎盘组织核转录因子5和单核细胞趋化蛋白-1的表达与巨噬细胞
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本文发表于《中华围产医学杂志》2016年12期相关推荐
1、间充质干细胞来源的外泌体在子痫前期中的实验研究进展2、普伐他汀防治子痫前期的有效性及安全性的研究进展3、淋巴细胞活化基因3、程序性细胞死亡蛋白1及其配体1 在子痫前期蜕膜淋巴细胞中的表达
本文引用格式：崔世红, 高亚南, 张琳琳, 等. 重度子痫前期胎盘组织核转录因子5和单核细胞趋化蛋白-1的表达与巨噬细胞浸润 [J] . 中华围产医学杂志,2016,19 (12): 920-926. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2016.12.008.
崔世红 高亚南 张琳琳 刘灵 吴娟 陈娟 申琳娜 职云晓
作者单位：450052 郑州大学第三附属医院产科
【摘 要】
目的 探讨核转录因子5（nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、CD68标记的巨噬细胞在不同类型的重度子痫前期胎盘组织中的表达及三者之间的相关性。
方法 收集2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院住院行剖宫产分娩的早发型重度子痫前期31例（早发组）、晚发型重度子痫前期30例（晚发组），以及同期30例正常孕妇（对照组）的胎盘组织。免疫组化法检测胎盘组织中NFAT5、MCP-1的表达及蜕膜组织中CD68标记的巨噬细胞水平；实时荧光定量聚合酶链反应技术检测胎盘组织中MCP-1和NFAT5的mRNA表达情况，并对蜕膜中的巨噬细胞水平与胎盘组织中NFAT5和MCP-1的mRNA表达进行相关性分析。采用单因素方差分析、t检验、χ2检验、Pearson相关分析进行统计学分析。
结果 （1）3组胎盘中NFAT5蛋白表达位于胎盘滋养细胞的胞核与胞质中，绒毛血管内皮细胞内有少量的表达；MCP-1蛋白表达于滋养细胞及绒毛血管内皮细胞周围的胞质内。早发组NFAT5蛋白表达阳性率明显高于晚发组[94%（29/31）与70%（21/30），χ2=5.720，P=0.017]及对照组[53%（16/30），χ2=12.743，P=0.001]。早发组MCP-1蛋白表达阳性率明显高于晚发组[90%（28/31）与70%（21/30），χ2=3.985，P=0.046]及对照组[43%（13/30），χ2=15.276，P=0.001）]。（2）早发组NFAT5 mRNA表达明显高于晚发组（1.07±0.03与0.92±0.02，P=0.001）及对照组（0.90±0.04，P=0.001）。早发组MCP-1 mRNA表达明显高于晚发组（1.08±0.12与1.02±0.08，P=0.001）和对照组（0.99±0.02，P=0.001）。（3）早发组巨噬细胞计数高于晚发组[（26.18±1.17）与（9.78±0.31）个，t=75.358，P＜0.001]，晚发组显著高于对照组[（9.78±0.31）个与（9.47±0.61）个，t=2.481，P＜0.05]。（4）早发组中NFAT5 mRNA的表达与MCP-1mRNA的表达呈正相关（r=0.554，P=0.001），NFAT5 mRNA的表达与巨噬细胞计数呈正相关（r=0.527，P=0.003）；MCP-1 mRNA的表达与巨噬细胞计数呈正相关（r=0.395，P=0.031）。
结论 NFAT5和MCP-1在早发型子痫前期的发病过程中可能有一定的作用。
【关键词】 先兆子痫；NFATC转录因子类；趋化因子CCL2；巨噬细胞
基金项目：河南省医学科技攻关项目子痫前期超声血流监测与围产儿结局的研究项目（201503109）
子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的一种复杂的多系统紊乱性疾病，多在妊娠20周后出现高血压、蛋白尿等临床症状。全球每年约有7.6万产妇及50万婴儿因此病死亡[1]。子痫前期也是国内产科关注的危急重症之一[2]。近20年来，子痫前期的发病机制研究已逐渐深入到胎盘的病理生理。目前认为，子痫前期发生的根本原因是胎盘缺血缺氧引发的大量可溶性分子与毒素进入母体循环，与机体氧化应激、炎症反应、血管内皮损伤、母胎界面的固有免疫失衡等有关。国外对于胎盘局部高渗状态的研究显示，细胞在高渗状态下脱水后，可引起细胞内电解质浓度增加，进而导致细胞凋亡，而有机渗透物质（如山梨糖醇与肌醇等）的积累会取代过度增多的电解质，使细胞适应高渗应激，且发现在胎儿生长受限模型的胎盘组织中，山梨糖醇、肌醇等有机渗透物质的浓度升高[3]。
核转录因子5（nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5）是与渗透压相关的转录因子，负责在高渗条件下维持细胞内外渗透压的平衡。最近研究表明，缺氧会诱导NFAT5的表达，在子痫前期患者中NFAT5高表达，体外实验模拟缺氧环境能够诱导人绒癌细胞JEG-3细胞内NFAT5的表达[4]。单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）是一类具有诱导白细胞定向迁移和活化作用的细胞因子，由巨噬细胞、滋养细胞、蜕膜细胞分泌，能够趋化单核巨噬细胞聚集到损伤的血管内皮周围，参与机体的免疫防御反应。Küper等[5]在研究腹膜透析的过程中，发现NFAT5激活后转移入核内，与MCP-1基因启动子部位DNA识别点结合，两者相互作用，可激活下游信号通路。目前，关于NFAT5、MCP-1及巨噬细胞与子痫前期发病的相关性研究较少。本研究通过检测早发型重度子痫前期（early-onset severe preeclampsia，EPE）、晚发型重度子痫前期（late-onset severe preeclampsia，LPE）及正常妊娠胎盘中NFAT5、MCP-1及巨噬细胞的表达，探讨胎盘组织内NFAT5、MCP-1与巨噬细胞的相关性及前两者结合后诱导的孕妇胎盘局部炎症反应与高渗环境在子痫前期发病机制中的作用。
资料与方法
一、研究对象
选取2015年1月至2016年1月在郑州大学第三附属医院住院行剖宫产分娩的61例重度子痫前期患者为试验组，其中EPE 31例（早发组），LPE 30例（晚发组）。另选取同期健康足月妊娠（因骨盆异常、臀位、社会因素等原因）行剖宫产术分娩的孕妇30例作为对照组。
重度子痫前期的诊断标准参照美国妇产科医师学院标准（2016）[6]，各组孕妇均为单胎妊娠，此次妊娠均为自然受孕，未采取辅助生殖技术；各组孕妇均无高血压、糖尿病、心脏病以及肾脏疾病史。
本研究方案经过郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意并签署知情同意书。
二、研究方法
1.一般资料的收集与整理：收集3组研究对象的年龄、分娩孕周、分娩前体重指数（body mass index，BMI）、孕妇住院后未治疗前的24 h尿蛋白、新生儿出生体重等信息。
2. 标本采集及处理：行剖宫产术后15 min内，取母体面中央区域的胎盘组织（约1.0 cm×1.0 cm ×1.0 cm）2块，避开出血、梗死及钙化区，4 ℃生理盐水漂洗（尽量洗净血液）后，其中一块置于无菌无酶的1.5 ml离心管中，立即投入液氮冷却，后转－80 ℃冰箱保存备用。另一块固定于10%甲醛溶液，常规石蜡包埋切片。
3. 免疫组织化学法检测胎盘组织MCP-1、NFAT5、CD68的表达：兔抗人NFAT5多克隆抗体和兔抗人MCP-1单克隆抗体（北京博奥森公司），以及鼠抗人CD68单克隆抗体（福州迈新生物技术）作为一抗，最终进行SP染色，试验步骤按试剂盒提供的方法操作。采用日本Olympus IX-7荧光显微镜观察结果。滋养细胞胞膜或胞质呈棕黄色颗粒或黄褐色颗粒者为阳性表达。
免疫组化结果判定：在400倍镜下选取5个视野，每个视野计数100个细胞，以平均每100个细胞中含阳性细胞个数作为阳性细胞率，参考赵先兰等[7]的综合计分法进行半定量分析。对应观察CD68免疫组化片，以细胞质呈棕黄色或棕褐色为阳性，400倍光镜下计数，随机计数10个高倍视野，取其平均值为该病例蜕膜中的巨噬细胞数[8]。
4.实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测胎盘组织中MCP-1、NFAT5 的mRNA表达：RNA快速抽提试剂（购自北京康为试剂公司）提取总RNA，逆转录为cDNA，染料法进行RT-PCR。MCP-1、NFAT5引物由上海生工有限公司合成，引物及内参的合成见表1，RT-PCR的反应条件和操作按说明书进行，重复3次，记录循环阈值（cycle threshold，Ct）的平均值，计算各组2-ΔΔCt值。
三、统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；计数资料用频数及率表示，组间比较采用χ2检验；相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
结 果
一、一般情况
3组间孕妇年龄、分娩前BMI比较，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。早发组分娩孕周、新生儿出生体重、24 h尿蛋白分别与对照组和晚发组比较，差异均有统计学意义（P值均<0.01），见表2。
二、胎盘组织NFAT5与MCP-1蛋白的表达
NFAT5蛋白表达主要位于胎盘滋养细胞的胞核与胞质，血管内皮细胞和绒毛间质细胞也有极少量的弱阳性细胞，呈高于背景棕黄色与棕褐色颗粒染色，着色不均匀，早发组NFAT5的分布与晚发组一致，但NFAT5阳性细胞数量明显增多，染色增强，呈高于背景的棕色阳性染色，整个胎盘间质细胞呈淡棕色染色。见图1。
MCP-1蛋白表达于滋养细胞及绒毛血管内皮细胞周围的胞质内，呈棕黄色或棕褐色颗粒染色，孕妇胎盘组织内MCP-1阳性细胞数量明显增多，染色强度也明显增强。晚发组孕妇胎盘组织内MCP-1主要见于细胞滋养细胞，呈棕黄色弱阳性表达。见图2。
早发组与晚发组胎盘中NFAT5、MCP-1表达强度差异均有统计学意义；而晚发组与对照组比较，差异均无统计学意义。见表3。
三、胎盘蜕膜基板处巨噬细胞数的比较
早发组、晚发组和对照组巨噬细胞计数分别为（26.18±1.17）、（9.78±0.31）和（9.47±0.61）个，早发组高于晚发组，晚发组高于对照组（t值分别为75.358和2.481，P值分别为＜0.001和＜0.05）。见图3。
四、胎盘组织NFAT5与MCP-1 mRNA的表达
NFAT5 mRNA与MCP-1 mRNA的表达，早发组分别与晚发组和对照组比较，差异均有统计学意义（P值均＜0.01），但晚发组与对照组比较，差异均无统计学意义（P值均＞0.05），见表4、图4~5。
五、早发组中NFAT5 mRNA、MCP-1 mRNA与巨噬细胞数相关性
早发组中NFAT5与MCP-1 mRNA呈正相关（r=0.554，P=0.001）；NFAT5 mRNA与CD68标记的巨噬细胞表达数量呈正相关（r=0.527，P=0.003）；MCP-1的mRNA的表达与巨噬细胞表达数量呈正相关（r=0.395，P=0.031）。
讨 论
一、重度子痫前期胎盘组织中NFAT5的表达及意义
胎盘作为联系孕妇与胎儿的唯一纽带，担负着物质运输、合成激素、防御病原体的职责。胎盘发育不全是子痫前期发病的重要原因，其中胎盘异常包括胎盘内缺氧、滋养细胞凋亡、螺旋动脉重塑不足[9]。前期研究已经证实当人类与绵羊脐血中摄入有机渗透物质后，山梨糖醇、肌醇等有机渗透物质以及NFAT5渗透转录因子在胎盘组织滋养细胞内积聚[10]。小鼠肾脏细胞内，渗透压升高可导致NFAT5激活，促进渗透压保护基因醛糖还原酶、钠离子依赖的肌纤维醇转运蛋白的表达[11]。妊娠早期胎盘发育处于低氧环境中，而持续缺氧会导致子痫前期和胎儿生长受限等妊娠并发症，Dobierzewska等[12]发现子痫前期患者胎盘组织内NFAT5蛋白的表达与对照组比较明显升高，而且在胎盘绒毛癌细胞（JAR细胞）内，低氧可诱导NFAT5 mRNA的表达。本研究结果显示3组孕妇的胎盘组织中均有NFAT5 mRNA及其蛋白表达，主要定位于绒毛滋养细胞与血管内皮细胞内，早发组高于晚发组，差异有统计学意义，提示早发组胎盘病理改变较严重，持续缺血缺氧诱导各种细胞毒性因子的释放，致使胎盘组织内微环境改变，而NFAT5的激活，可通过调节各种渗透物质的表达，使子痫前期患者胎盘组织滋养细胞适应这种不利的环境。但晚发组与对照组比较差异无统计学意义，根据前期研究显示，晚发型子痫前期多为母源性子痫前期，胎盘发育相对正常[13]。
二、重度子痫前期胎盘组织中MCP-1与巨噬细胞浸润的表达及其意义
近年来研究证明，MCP-1与子痫前期的发生发展密切相关。Katabuchi等[14]研究发现血清MCP-1水平在子痫前期组明显高于正常孕妇组，且重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组。Hwang等[15]通过RT-PCR技术与蛋白印迹实验发现，MCP-1的表达在子痫前期组与对照组存在差异，以上均表明MCP-1参与了子痫前期的发生和发展。本研究通过免疫组化实验与RT-PCR技术检测到子痫前期胎盘组织中有较高水平的MCP-1表达，而正常组织仅表达极弱的MCP-1，说明MCP-1参与了子痫前期的病理损害过程。本实验结果还发现，早发组胎盘组织中MCP-1 mRNA和蛋白表达明显高于晚发组，晚发组与对照组相比无明显差异，提示MCP-1在早发型子痫前期胎盘病理损害的过程中起着重要的作用。
Reister等[16]研究发现，在子痫前期患者胎盘床处巨噬细胞明显增多，而滋养细胞浸润减少，体外实验通过将活化巨噬细胞与滋养细胞共培养，加入肿瘤坏死因子-α、色氨酸耗竭的培养液，滋养细胞凋亡明显增加；而加入肿瘤坏死因子-α抗体与色氨酸后，滋养细胞凋亡明显减少；而Kaufmann等[17]发现子痫前期患者体内巨噬细胞也明显增多，认为巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α、耗竭色氨酸诱导滋养细胞凋亡，进而抑制其对螺旋动脉的侵入；而Kim等[18]研究认为重度子痫前期患者蜕膜巨噬细胞与对照组相比无明显差异。本研究结果显示巨噬细胞在重度子痫前期患者蜕膜组织中呈强阳性表达，主要分布于螺旋动脉周围，与Kaufmann等[17]的研究结果一致。Lockwood等[19]发现在子痫前期患者胎盘组织内MCP-1的表达水平显著升高，过多的巨噬细胞进入蜕膜，使得滋养细胞与螺旋动脉之间形成屏障而分离，导致子痫前期发生。本实验结果发现MCP-1主要定位于绒毛血管内皮细胞与滋养细胞内，与Marketou等[20]的研究一致，另外发现MCP-1的表达与巨噬细胞具有相关性，提示MCP-1是炎症细胞浸润及局部炎症反应的一个重要因子，巨噬细胞的浸润可能受MCP-1趋化作用的影响。
三、NFAT5、MCP-1和巨噬细胞与子痫前期的关系
MCP-1的基因启动子部位含有结合NFAT5的一个基因片段[21]。本实验利用免疫组化技术检测到正常组孕妇胎盘组织中可出现少部分的滋养细胞表达较弱的NFAT5，提示适量的NFAT5活化可能是调节正常胎盘滋养细胞所必须的。NFAT5的表达与MCP-1的表达、CD68标记巨噬细胞呈显著正相关，MCP-1的表达与CD68标记巨噬细胞呈显著正相关。可以推测，NFAT5的活化对于人类子痫前期胎盘组织内巨噬细胞向蜕膜组织的浸润可能起着重要的调控作用，同时也提示MCP-1可能是NFAT5启动活化的炎性因子之一。
本研究初步探讨了NFAT5在重度子痫前期胎盘中的表达和定位，以及与MCP-1和巨噬细胞之间的密切关系，为子痫前期的发病机制提供了新的思路，也为下一步进行体外实验奠定了基础。NFAT5及MCP-1参与重度子痫前期发病的具体机制还有待进一步研究。
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