酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型猪
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
动物品系：西藏小型猪；
等级：普通级；
动物规格：230-250日龄，雌性，45头；340-360日龄，雌性，9头；340-360日龄，雄性，2头；
出售单位：南方医科大学；
实验单位：南方医科大学；
伦理审查号：L2016088；
合格证编号：44002100009463；44002100009464；44002100009465；
实验单位使用许可证编号：SYXK（粤）2011-0074；
许可证号：SCXK（粤）2011-0015。
本研究所用的西藏小型猪均在南方医科大学实验动物中心饲养。所有都经南方医科大学实验动物福利与伦理委员会（IACUC）批准。所有手术均在麻醉下进行，并尽可能减少动物的痛苦。
3.1.2 试剂耗材
麦管（0.25 mL，法国，IMV）；
载玻片（7101，国产，帆船牌）；
PZM-3培养液（需配制，表1）；
TCM-199操作液（需配制，表2）；
胚胎水 (W1503，美国，Sigma)；
矿物油（M8410，美国，Sigma）；
Premix Taq（R004A，日本，Takara）；
pMD19-T Vector Cloning Kit（6013，日本，Takara）；
TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（9762，日本，Takara）；Age I限制性内切酶（R3552，美国，New England Biolabs）；
Bsa I限制性内切酶（R3535，美国，New England Biolabs）；
Phusion 超保真 DNA 聚合酶（M0530，美国，New England Biolabs）；MEGAshortscript T7 kit（AM1354，美国，Life Technologies）；
mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit（AM1345，美国，Life Technologies）；
Cas9表达载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 （44758，美国，Addgene）；
sgRNA克隆载体pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin（51133，美国，Addgene）；
RNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH<5.0）（P1011，中国，北京索莱宝科技有限公司）；
DNA抽提试剂（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，pH>7.8）（P1012，国产，北京索莱宝科技有限公司）
质粒小提试剂盒（DP103，中国，天根生化科技有限公司）；
血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304，中国，天根生化科技有限公司）；
四烯雌酮（CAS 850-52-2，国产，北京市科益丰生物技术发展有限公司）
1%结晶紫水溶液（G1059，国产，北京索莱宝科技有限公司）
甲醇（分析纯，国产，天津市大茂化学试剂厂）
Dubecco's磷酸缓冲液（P1002，国产，北京索莱宝科技有限公司）
青霉素钾（国产，成都中牧生物药业有限公司）
硫酸链霉素（国产，华北制药集团动物保健品有限责任公司）
手术切口无菌膜（海壳生，国产，上海海纯生物有限公司）
可吸收线（金环，国产，上海浦东金环医疗用品股份有限公司）
常用手术器械（金钟，国产，上海医疗器械有限公司手术器械厂）
宠物用留置针（海迪科，国产，山东海迪科医用制品有限公司）
毛细玻璃管（规格1.0×0.6×100 mm，国产，北京正天易科贸有限公司）
保温瓶（SSAM-B1500，国产，上海万盛保温容器有限公司）
常用手术耗材（国产，纱布、棉签、棉球、碘酊、刀片等）
不同规格的培养皿、离心管、EP管、吸头等（美国，Corning）
血液生理分析试剂（日本，Sysmex厂家配套试剂）
血生化检测试剂（见表19，国产，北京九强生物技术有限公司）
3.1.3 仪器设备
高速冷冻离心机（3K18，美国，Sigma）
PCR扩增仪（PTC 200，美国，Bio-Rad）
凝胶成像系统（GelDoc EQ，美国，Bio-Rad）
超低温冰箱（-80℃）（702，美国，Thermo）
紫外分光光度计（NanoDrop 2000，美国，Thermo）
高速离心机（Centrifuge 5418，德国，Eppendorf）
核酸蛋白测定仪（Biophotometer 6131，德国，Eppendorf）
电泳仪（DYY-2C，国产，北京市六一仪器厂）
紫外透射仪（GL-312，国产，江苏海门市麒麟医用仪器厂）
电子分析天平（BT224S，国产，赛利多斯科学仪器有限公司）
生化培养箱（SPX-250B，国产，上海福玛实验设备有限公司）
电热恒温水浴锅（HWS12，国产，上海一恒科学仪器有限公司）
细菌恒温摇床（SPH-210A，国产，上海双旭电子有限公司）
洁净工作台（SW-OJ-2FD，国产，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）
生物安全台（HFsafe-1800，国产，上海力申科学仪器有限公司）
高压蒸汽消毒器（HVE-50，日本，HIRAYAMA Manufacturing Corporation）
金属浴（TOMCS BG25，国产，杭州朗基科学仪器有限公司）
恒温热台（TP-CK05，日本，TOKAT HIT）
拉针仪（P-97，美国，SUTTER INSTRUMENT Company）
煅针仪（MF-900，日本，NARISHIGE Company）
体视显微镜（SZX10，日本，OLYMPUS）
显微注射显微镜（CKX41SF，日本，OLYMPUS）
显微操作仪（TransferMan NK2，德国，Eppendorf）
移液枪（各量程，德国，Eppendorf）
血液分析仪（XT-1800i，日本，Sysmex Corporation）
荧光显微镜（BX43，日本，OLYMPUS）
包埋机（EG1160，德国，Leica）
切片机（RM2245，德国，Leica）
烘片机（HI1220，德国，Leica）
摊片机（HI1210，德国，Leica）
3.1.4 软件系统
SPSS统计分析软件（IBM SPSS 20.0）
Toup View软件系统（国产，北京拓普视野科技有限公司）
3.1.5 试剂配制
（1）PZM-3培养液配制：
表1 PZM-3胚胎培养液
Table 1 PZM-3 Culture medium
（2）TCM-199操作液配制：
表2 TCM-199操作液
Table 2TCM-199 Manipulation medium
3.2 实验方法3.2.1 设计和构建CRISPR/Cas9系统
（1）首先通过Ensembl genome browser数据库了解猪的TYR基因的基因序列（尤其是外显子序列及编码区）及蛋白结构功能，选择合适的敲除基因位点。注意：不同猪种间的基因序列可能突变差异，应以本实验西藏小型猪的测序结果为准，不应完全按照网上数据库。
（2）通过在线网站（http://crispor.tefor.net/）针对西藏小型猪的TYR基因序列设计sgRNA。
（3）根据设计的sgRNA序列，设计出反向互补的双链，并在双链上分别添加与sgRNA空载连接的接头，则需成在上链的5’端前面添加CCGG，需在下链的5’端前面添加AAAC，合成带接头的oligos（表3）。
表3 oligos序列
Table 3 Oligossequence
（4）将oligos磷酸化，然后退火形成带粘性末端的短片段双链DNA。反应体系见表4，反应条件为：先在37℃中反应30 min，然后置于装有1 L开水的烧杯中煮沸5 min，最后待烧杯中的水自然冷却至常温后取出反应物。
表4 PNK退火反应体系
Table 4-2PNK annealing reaction system
（5）酶切sgRNA克隆载体pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin，酶切反应体系按表5，反应条件为37℃孵育过夜。
表5 酶切反应体系
Table 5Enzymatic reaction system
（6）将步骤5中得到的酶切产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收长片段DNA。
（7）连接构建sgRNA表达载体，反应体系按表6，反应条件为16℃孵育30-60 min。
表6 连接反应体系
Table 6Connection reaction system
（8）将步骤7的产物直接用于质粒转化。然后挑取单克隆，送菌液或质粒测序（测序引物为U6通用引物，正向测序），根据测序结果选取构建正确的sgRNA质粒。3.2.2 sgRNA的制备
3.2.2.1 sgRNA的体外转录模板制备
用高保真DNA聚合酶对sgRNA质粒进行PCR扩增。PCR引物按表8，反应体系按照表9，反应条件如表10。得到带T7启动子的sgRNA体外转录模板后，进行2%琼脂糖胶TBE电泳，判断条带大小是否符合预期：sgRNA体外转录模板大小为约120 bp。获得后的体外转录模板采用苯酚/氯仿/异戊醇进行抽提，乙醇和乙酸钠沉淀纯化。
表8 引物序列
Table 8Primer sequence
表9 PCR反应体系
Table 9PCR reaction system
注：需要制备6管PCR产物，因为PCR产物达300 μL以上便于进行DNA纯化。
Note:Six tubes of PCR products need to be prepared, because the PCR products aremore than 300 μL, which is convenient for DNA purification.
表10 PCR反应条件
Table 10 PCR reaction conditions
3.2.2.2 sgRNA的体外转录和纯化
将已纯化的sgRNA体外转录模板用T7体外转录试剂盒（MEGAshortscript T7 kit）进行体外转录。合成的sgRNA经核酸纯化后才能用于显微注射。
（1）首先进行体外转录反应合成sgRNA，反应体系按表11，反应条件为37℃，4 h。
表11 体外转录反应
Table 11 In vitro transcription response system
注：T7 Reaction Buffer需恢复至常温才可加入到体系中，否则低温条件下其成分可引起DNA模板产生沉淀。
Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.
（1）然后去除DNA模板：加入1 μL TURBO DNase，反应条件为37℃，15 min。
（2）最终获得的sgRNA用苯酚/氯仿/异戊醇进行抽提，乙醇和乙酸钠沉淀纯化。
3.2.3 Cas9 mRNA的制备
3.2.3.1线性化质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
酶切酶切反应体系见表12，反应条件：37℃温浴，酶切消化过夜。
表12 酶切反应体系
Table 12 Enzymatic reaction system
注：要消化至少30 μg的质粒才利于下一步做体外转录模板的纯化。酶切产物需取少量进行琼脂糖电泳鉴定，确保酶切完全，所有质粒被线性化。
Note: It is necessary to digest at least 30 μg of plasmids forfurther purification of in vitro transcription template. A small amount ofenzyme products need to be identified by agarose electrophoresis to ensurecomplete enzyme digestion and all plasmids are linearized.
3.2.3.2Cas9体外转录模板的纯化
质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9被完全线性化后，为了去除RNA酶和其他杂质，采用苯酚/氯仿/异戊醇进行抽提，乙醇和乙酸钠沉淀，纯化后作为体外转录模板。
3.2.3.3体外转录Cas9 mRNA
将纯化后的Cas9体外转录模板用T7启动子体外转录试剂盒（mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit）进行体外转录。合成显微注射用的Cas9 mRNA需要分3步：
（1）首先进行体外转录反应，形成初步的mRNA，反应体系参照表13，反应条件为37℃，2 h。
表13 体外转录反应
Table 13 In vitro transcription response system
注意：T7 Reaction Buffer需恢复至常温才可加入到体系中，否则低温条件下其成分可引起DNA模板产生沉淀。
Note:T7 reaction buffer can be added to the system only after it is restored tonormal temperature, otherwise, its components can cause DNA template toprecipitate under low temperature.
（1）去除DNA模板：加入1 μL的TURBODNase，反应条件为37℃，15min。
（2）对mRNA加入polyA序列，使mRNA更稳定性，反应体系参照表14，反应条件为37℃，30-45min。
表14 加polyA反应体系
Table 14 Add polyA reaction system
注意：反应完成后应立刻进行Cas9 mRNA纯化，防止RNA降解。
Note: Cas9 mRNA should be purified immediately after thereaction to prevent RNA degradation.
3.2.3.4Cas9 mRNA的纯化
为了去除RNA酶和其他杂质，先用苯酚/氯仿/异戊醇抽提RNA，再用乙酸钠和乙醇沉淀RNA。全程要注意采用无RNA酶的枪头和手套。最后要加入适量的胚胎水溶解Cas9 mRNA，并分装于无RNA酶的PCR管中（4 μL/管），-80℃冰箱保存。Cas9 mRNA要保证浓度大于500 ng/μL。
3.2.4 同步发情
选择4-7头健康的性成熟雌性西藏小型猪（7月龄以上）作为供卵母猪，进行同步发情处理。每头母猪每日早上8点喂服20 mg四烯雌酮口服乳浊液，一日一次，持续服用18天。停药后第4天始，每天早晚各观察发情一次，大部分母猪会在停药后5-8天内出现发情。
3.2.5 发情配种
母猪在停止喂服四烯雌酮后第5天左右开始有发情迹象，阴道变红变肿。这时每天用公猪试情1-2次，诱导母猪发情更加同步。在上午清洁栏舍前或下午四点左右观察发情。西藏小型猪在发情早期会爬跨其他母猪，圈舍地面较平时脏乱。当西藏小型猪处于发情中期时遇公猪会静立不动，此时人用手按压其背部，母猪也静立不动。当母猪进入发情后期，阴道红肿会消退，拒绝公猪交配。西藏小型猪单笼饲养时不易观察发情，但母猪发情时会表现进食减少、烦躁不安。
通过阴道细胞涂片结晶紫染色法来判断母猪是否已达到最佳发情状态。首先将棉签轻轻地插入母猪阴道并旋转数圈。抽出棉签，将阴道物均匀涂布在载玻片上，并自然晾干（棉签在玻片上应朝一个方向滚动涂布，不可重复涂布，避免细胞重叠影响观察）。然后载玻片用甲醇脱水30 s，并自然晾干。接着结晶紫溶液染色1 min。最后用清水冲洗3次，并再次晾干，显微镜下观察。在普通光学显微镜下观察涂片上的表皮细胞的大小、形态及比例等来判断西藏小型猪的发情阶段。当镜下观察到大部分细胞为边缘皱褶、体积较大且无细胞核的完全角质化鳞状上皮细胞时，母猪处于最佳发情状态。当母猪表现为静立发情，且阴道细胞涂片提示处于最佳发情阶段时，进行配种。采用自然交配方式或人工授精方式进行配种。
3.2.6 体内冲卵
供卵母猪在配种后16-18 h要进行取卵手术，收集单细胞期受精卵。具体步骤如下：（1）术前母猪禁食12 h；（2）静脉注射戊巴比妥钠溶液（用量为30-45 mg/kg）进行麻醉；（3）下腹部剃毛备皮、清洗、手术消毒；（4）在下腹鼠蹊部肌间隙处开出4-6 cm手术切口；（5）将食指和中指从术口探入腹腔内，凭手指触觉分辨出子宫角（相对于肠而言，子宫角壁较厚一些），用双指轻轻将其夹出，将卵巢和输卵管暴露在手术视野中；（6）将无菌塑料导管的一端从输卵管伞部天然开口处插入，另一端置至塑料平皿上；（7）在输卵管子宫角交接处靠近输卵端轻轻插入一根留置针。同时用手捏紧靠近子宫角的输卵管，防止冲卵时液体进入子宫；（8）用注射器将含0.1%牛血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲溶液从留置针处推入，液体和胚胎经输卵管从伞部开口沿塑料导管被冲入塑料平皿中；（9）在视显微镜下用口吸管捡卵，将卵移至操作液滴中。注意：显微镜应带恒温热台，保持38.5℃。
3.2.7 胚胎运输
猪胚胎应在38.5℃保持活力，当猪卵暴露在低温环境中时极易死亡，采集到的胚胎必须严格恒温运输。采用简易装置进行短途运输 ADDINNE.Ref.{77F6BCEF-A63D-4062-9063-977DEDBF0A73}[12]，步骤如下：（1）先用无菌麦管依次吸入：约1 cm的TCM-199操作液液段，约1 cm的空气段，约1.5 cm含有胚胎的TCM-199操作液液段，约1 cm的空气段，约1 cm的TCM-199操作液液段；（2）将麦管两端用烧热的钳子封管；（3）将麦管一端固定在泡沫浮标中；（4）再将麦管和浮标装入有38.5℃温水的真空保温瓶中，并尽快送回实验室。
3.2.8 胚胎培养
显微注射前应将胚胎放入PZM-3培养基液滴中，在含5% CO2的38.5℃培养箱培养半小时以上。注意：PZM-3液滴需要在取卵前一天晚上做好，放入CO2培养箱中平衡12 h才能使用。显微注射操作时，将胚胎移至于含TCM-199的操作液中。
3.2.9 显微注射
配制显微注射的RNA溶液中，Cas9 mRNA的终浓度是100 ng/µL，每种sgRNA的终浓度均为50 ng/µL。在受精卵处于单细胞期或二细胞期时进行胞质内注射。二细胞期注射时，对卵中的每个细胞分别进行注射。本研究采用的是TransferMan NK2显微注射操作系统。完成显微注射后，将胚胎移至平衡好的PZM-3培育基中，于含5% CO2的38.5℃培养箱中培养1 h，再进行胚胎移植。
3.2.10 胚胎移植
西藏小型猪胚胎移植通过手术进行。一般每头代孕母猪移植10～15枚受精卵。对处于发情期的代孕母猪进行麻醉后，剃毛、备皮、消毒、铺巾。在下腹鼠蹊部开一小口，露出卵巢和输卵管。将胚胎吸至胚胎移植管，吸入的液体和空气尽可能少。将胚胎移植管轻轻从输卵管伞部开口插入，进至输卵管第一个大弯曲之后。将移植管内含胚胎的液体注入输卵管，并把移植管退出，然后将卵巢和输卵管放回腹腔，逐层缝合伤口。胚胎移植一般只需移植一侧的输卵管即可。术后连续3天肌肉注射青霉素和链霉素预防感染。移植后第19～21天及第40天，用猪验孕卡或B超仪检测是否妊娠，妊娠过程中留意代孕母猪有无返情。3.3 结果 利用CRISPR/Cas9受精卵胞质注射法制备基因修饰西藏小型猪的基本流程图3所示。针对TYR基因设计了2条sgRNA（图4）。74枚西藏小型猪受精卵经胞质内注射Cas9 mRNA和sgRNA混合物后，分别移植至7头代孕母猪身上，其中4头代孕母猪成功怀孕（分别称为代孕母猪A、B、C和D，C和D除了TYR基因编辑外，同时还编辑了其他基因，因而所产的F0代不纳入白化保种范围，只能用于效率统计）。代孕母猪A、B、C、D各自产下了4头仔猪。妊娠的代孕母猪都在114天左右自然分娩，没有发现妊娠期延长或胎儿发育落后的现象（表15）。出生的16只F0代仔猪中，公与母的性别比为9:7，产仔数与移植胚胎数的比率在33.3%到50%之间（表15）。16只F0代仔猪中有12只（即a2、a3、a4、b5、b6、b7、b8、c9、c12、d14、d15和d16）呈完全白化表型，剩下仔猪a1和c10为黑色表型，而仔猪c11和d13为部分色素缺失表型（图5，A-D）。
图3 利用CRISPR/Cas9受精卵胞质注射法制备基因修饰西藏小型猪
Figure3 Generating gene-modified Tibetminipigs by CRISPR/Cas9 cytoplasmic injection
图4 sgRNA设计位点示意图
Figure 4 Schematic diagram of sgRNA design loci.
图5 F0代仔猪
（A）代孕母猪A产下仔猪a1-a4；（B）代孕母猪B产下仔猪b5-b8；（C）代孕母猪C产下仔猪c9-c12；（D）代孕母猪D产下仔猪d13-d16。
Figure5 F0 generation piglets
(A) Surrogate A gave birthto piglets a1 - a4; (B) Surrogate B gave birthto piglets b5 - b8. (C) Surrogate C gave birthto piglets c9 - c12; (D) Surrogate D gave birthto piglets d13 - d16.
表15 受精卵胞质注射法制备基因修饰西藏小型猪
Table15 Generating gene-modified Tibetminipigs by cytoplasmic microinjection
注：C和D进行了双基因编辑，经仅供计算效率，双基因编辑藏猪不用于后期白化藏猪品系的培育。