阿拉斯加狭鳕鱼明胶密封剂对猪模型肺部漏气的疗效
摘 要
背景：术后长时间的漏气是肺切除术后经常出现的并发症。我们开发了一种新的密封剂，基于疏水性改性的阿拉斯加狭鳕明胶（ApGltn）密封剂。本研究的目的是评估ApGltn密封剂与纤维蛋白密封剂相比，在体外和体内模型中使用新的喷雾系统的粘合强度。
方法：在体外和体内的猪模型中建立了胸膜缺陷，并将ApGltn密封剂或纤维蛋白密封剂应用于此。通过逐步增加气道压力来评估耐压性，以确认密封部位的空气泄漏。获得覆盖有每种密封剂的组织样本进行组织学评估。
结果：在体外实验中，ApGltn密封剂的泄漏压力明显大于纤维蛋白密封剂（分别为102.94 ± 15.6 cmH2O和28.37 ± 5.1 cmH2O）（P < 0.01）。在体内实验中，ApGltn密封剂的泄漏压力也明显大于纤维蛋白密封剂（分别为68.82 ± 18.04 cmH2O和43.33 ± 7.13 cmH2O）（p = 0.043）。组织学检查证实，ApGltn密封剂紧紧地粘附在胸膜和胸膜缺损表面。
结论：ApGltn密封剂在体外和体内的猪肺中具有足够高的粘合质量，可以认为它适合并有效地用于预防肺部漏气。
术后长期漏气，一般是指漏气时间超过5或7天，是肺切除术的常见并发症，发生率为5.6%至17.6%。长时间的漏气有时需要额外的干预，如胸膜剥脱术或再次手术，导致住院时间延长，费用增加。此外，它还可能引起并发症，如分别有8.2%和13.3%的病例出现肺水肿和肺炎。
据报道，一些密封剂可以有效地防止术后漏气。特别是，纤维蛋白密封剂一般用于普通胸腔手术。虽然经常用于控制漏气或出血，但纤维蛋白密封剂有几个缺点。首先，它的粘合质量达不到可以自行防止漏气的水平，因为胸外科医生经常发现纤维蛋白胶不能密封漏气，还会导致术后复发漏气。此外，它的顺应性差，在呼吸时胸膜表面反复膨胀，它可能会从胸膜表面剥离。其次，由于它是人类血液的衍生物，因此存在着对传染病传播风险的一般性担忧，特别是人类B19小病毒，以前有报告称20.7%的病例会传播。
明胶具有直接的细胞粘附特性，具有低免疫原性和高生物相容性等优点，被认为适合于其作为密封剂的临床应用。我们开发了一种新的密封剂，基于疏水性改性的阿拉斯加狭鳕来源的明胶（ApGltn）密封剂和聚乙二醇基4臂交联剂，季戊四醇聚乙二醇醚四琥珀酰谷氨酸酯（4S-PEG）。ApGltn来源于一种冷水鱼，在室温下呈液态，因为它的溶胶-凝胶转变温度为13.8℃，低于其他明胶的转变温度，如猪肉来源的明胶。因此，我们选择ApGltn来开发新的密封剂，以避免在应用前被加热溶解。此外，通过对ApGltn进行改性，将癸基作为疏水基团，我们增强了ApGltn密封剂在潮湿手术环境中的粘合强度。
我们以前用切除的猪肺评估了ApGltn密封剂的粘合效用。我们表明，与纤维蛋白密封剂相比，ApGltn密封剂在猪的切除肺表面具有更高的粘合强度和适应性。在目前的研究中，为了提高密封剂在胸外科领域的功效，日本住友电工集团有限公司（大阪）和日本横滨的Anest Iwata公司开发了一种新的喷雾系统，该系统具有改进的2种液体的均匀混合物，适用于微创手术（图1）。为了更实际地评估粘合剂的质量，猪肺被认为是合适的，因为它们的大小与人类的肺相似。因此，本研究的目的是评估ApGltn密封剂在体内的粘合质量，以及新喷雾系统在体外和体内的功效。
材料和方法
材料
阿拉斯加狭鳕衍生的明胶（Mw = 33,000）购自Nitta明胶公司（日本大阪）。n-癸醛购自东京化学工业有限公司（日本东京）。季戊四醇聚乙二醇醚四琥珀酰亚胺戊二酸酯（4S-PEG；SUNBRIGHT? PTE-200GS，MW = 20,000）购自NOF公司（东京，日本）。
组织密封剂和装置
ApGltn密封剂是一种原位水凝胶粘合剂，由癸酰基团改性的阿拉斯加狭鳕源性明胶和4S-PEG两种水溶液混合制备而成。由于更多的微小颗粒在更短的距离内被喷出，这种喷雾系统使两种液体的均匀混合得到了改善。纤维蛋白密封剂(Beriplast?; CSL Behring, Tokyo, Japan)以气溶胶的形式使用密封剂的附件喷雾装置进行喷射，气压为0.06至0.075兆帕。纤维蛋白密封剂是一种血液衍生物，由血液凝固因子、纤维蛋白原、XIII因子（FXIII）、凝血酶、抗纤维蛋白溶解剂（即阿普罗丁）和氯化钙组成。纤维蛋白密封剂模拟凝血级联的最后阶段，产生稳定的纤维蛋白凝块，通常用于控制漏气或出血。
体外粘接质量的评估
猪肺：从6个月大的猪（平均体重100公斤）身上获得的新鲜猪肺和气管购自东京芝浦造木（日本东京）。实验前，对肺部进行目视检查和通风，以检查是否有任何预先存在的胸膜损伤。我们排除了有胸膜损伤或膨胀性不足的猪肺。
猪肺表面的压力阻力
创建胸膜缺陷和耐压试验是按照以前描述的方案进行的。袖带式气管导管（尺寸为8.5毫米）被用来为肺部通气。随后，将肺部与机械呼吸机（PIXYS; Senko Medical Instrument Mfg. Co., Ltd., Tokyo, Japan）连接，并在肺叶上形成直径为10毫米、深度为1毫米的均匀圆形胸膜缺陷。在用15cmH2O的气道压力对肺部进行充气以恢复原来扩张的肺部体积后，夹住气管。使用一毫升的ApGltn密封剂或纤维蛋白密封剂溶液，使胸膜缺陷被完全覆盖。每种密封剂都用其专用的喷洒装置进行喷洒。加入一个没有密封剂的胸膜缺陷作为真正的对照组。将肺部放置5分钟以固定密封剂。将肺部浸入生理盐水箱中，温度保持在37℃。通气从15cmH2O开始，每分钟5cmH2O逐步递增，直至60cmH2O，这是呼吸机的最大压力。呼吸机的设置如下：压力控制通气，（呼吸频率12；吸气与呼气比=1：2；呼气末梢正压0)。
使用连接在气管导管上的压力计（LabChart v 8; AD Instruments, Nagoya, Japan）测量气管内压力。"泄漏压力 "被定义为气泡流从密封部位出现时的压力。如果密封持续到呼吸机的最大压力设置（60 cmH2O），则使用通气袋手动施加额外压力。
体内粘合剂质量的评估
动物准备和麻醉
四只雌性猪（27-29公斤）从日本农业合作社（日本东京）获得，并在筑波大学实验动物资源中心适应了一周。本研究依次使用双侧肺后叶（ApGltn组n = 4；fibrin组n = 4）。肌肉注射阿托品0.5毫克进行预处理后，通过肌肉注射氯胺酮20毫克/公斤和盐酸赛拉嗪2毫克/公斤进行初步镇静。用袖带式气管导管（7.5毫米）对动物进行插管。在吸入式麻醉下，用2%-3%的七氟烷和100%的氧气与机械呼吸机建立机械通气。呼吸机设置如下：压力控制通气，（呼吸频率20；吸气与呼气之比1：2；呼气末正压0；吸气压力15）。
手术过程
在动物处于侧卧位的情况下进行开胸手术，使用支气管内阻塞管（Coopdech?；Daiken Medical.Co.Ltd.，日本大阪）建立单肺通气。胸膜缺损的建立和密封剂的应用是按照以下方法进行的，同时静脉注射罗库溴铵（初始剂量为1毫克/千克，额外剂量为0.3毫克/千克）。在用15cmH2O的气道正压扩张肺部后，通过使用支气管内阻断器在主支气管内充气，保持肺部扩张。用手术刀制造一个直径为10毫米、深度为1毫米的胸膜缺陷。通过按压3分钟来止血（图2A）。在使用支气管内阻断器管维持15cmH2O的气道正压的情况下，用密封剂的喷雾装置套件将ApGltn和纤维蛋白密封剂各1毫升的溶液涂在胸膜缺陷的表面。让肺部静置5分钟以固定密封剂（图2B）。使用呼吸机将气道压力逐步增加5cmH2O，以确认密封部位的空气泄漏。通过在密封剂旁边轻轻倒入生理盐水，目测确认空气泄漏。如果密封持续到呼吸机的最大压力设置，即60 cmH2O，则使用通气袋手动施加额外压力。用连接到插管的压力计测量气道压力。从密封部位冒出的气泡流的压力被测量为泄漏压力。猪被安乐死了，用过量的静脉注射氯化钾。
组织学评估
用每种密封剂覆盖的胸膜缺陷病变的组织样本，以与耐压试验相同的准备方式进行组织学评估。样品用10%的福尔马林固定，嵌入石蜡中，用Elastica van Gieson染色。
伦理考虑
经筑波大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：18-400?19-156），并遵循我校《动物实验条例》和日本文部科学省管辖的《学术研究机构正确进行动物实验及相关活动的基本准则》，以人道的方式进行了动物实验。
统计学分析
各组之间的差异使用曼-惠特尼U检验和邦费罗尼校正进行耐压试验。显著性被设定为P < 0.05。数据显示为平均值±标准差。SPSS 21.0版（IBM公司，纽约，美国）用于所有的统计分析。
结 果
离体猪肺表面的抗压性
ApGltn 密封剂 (n = 5) 和纤维蛋白密封剂 (n = 5) 和无密封剂组 (n=5) 的泄漏压力分别为 102.94 ± 15.6 cmH2O、28.37 ± 5.1 cmH2O 和 18.02 ± 3.9 cmH2O . ApGltn 密封剂组的泄漏压力显着大于纤维蛋白密封剂组和无密封剂组（p < 0.01）（图 3）。事实上，ApGltn 密封剂组的 3 例在最大设置呼吸机压力 (60.0 cmH2O) 时没有漏气。因此，在这 3 个案例中，手动施加了额外的压力，导致最终泄漏压力为 106.08 cmH2O、147.73 cmH2O 和 124.23 cmH2O。
体内猪肺表面密封胶的耐压性
ApGltn 密封剂 (n = 4) 和纤维蛋白密封剂 (n = 4) 的泄漏压力分别为 68.82 ± 18.04 cmH2O 和 43.33 ± 7.13 cmH2O (p = 0.043)。ApGltn 密封剂的泄漏压力明显大于纤维蛋白密封剂的泄漏压力（图 4）。事实上，ApGltn 密封剂组的 2 例在最大设置呼吸机压力 (60.0 cmH2O) 时没有漏气。因此，在这 2 个案例中，手动施加了额外的压力，这导致了 80 cmH2O 和 87 cmH2O 的耐压性。这两种情况中的一种在手动施加最大压力的情况下没有出现漏气。
宏观发现
在 ApGltn 密封剂病例中，密封剂在充气和放气过程中与胸膜表面一致（补充视频）。密封剂从胸膜缺损边缘的裂缝中脱落（图 5A）。在纤维蛋白密封剂病例中，密封剂从密封剂外部广泛剥离并滑过肺表面（图 5B）。根据我们的观察，两种密封剂都不能阻止肺扩张。
组织学发现
Elastica van Gieson 染色显示 ApGltn 层紧紧地粘附在胸膜和胸膜缺损表面。在它们之间没有发现间隙（图 6A），而在纤维蛋白密封剂样本中的组织和密封剂之间发现了一些空隙空间（图 6B）。
评 论
术后漏气是肺切除术的常见并发症。术后长时间漏气（定义为漏气时间超过 5 天）与术中漏气量超过 500 ml/min 或术后第 2 天漏气量超过 180 ml/min 有关。因此，明显漏气肺应在术中进行修复，以防止术后出现进一步的并发症。漏气的外科手术，如缝合、结扎、钉合等，不仅会导致肺容量减少，还会导致偶发漏气，尤其是肺气肿等肺部病变患者。作为一种免缝合技术，在预防术后漏气方面具有重要作用。
多项前瞻性研究表明，各种密封剂是缩短漏气时间、肋间管引流和住院时间的有效方法。然而，即使在标准手术后使用密封剂处理漏气，仍有 24% 至 39% 的患者在术后 3 天内出现漏气。因此，预计密封剂的有效性可以提高。
离体实验表明，ApGltn 密封剂比我们之前的研究能够承受更高的气道压力。这被认为是由于使用了具有同心圆出口的新型喷雾系统的贡献，并且能够改进 2 种液体的均匀混合物，因为更多的微小颗粒以更短的距离喷射。在体内实验中，ApGltn 封闭剂经受了 68.8 cmH2O 的气道压力，明显高于纤维蛋白封闭剂所承受的气道压力。Gika 等人在体内比格犬肺中使用聚乙醇酸片的纤维蛋白密封剂包装方法显示出约 55cmH2O 的高粘合质量。这些结果表明，与具有聚乙醇酸片的纤维蛋白密封剂相比，ApGltn 密封剂本身具有更高的粘合酸片。
由于咳嗽时的声门下压力被认为约为 50 cmH2O，而肺实质压力低于此值，因此在临床使用中认为体内泄漏压力 (68.82 ± 18.04 cmH2O) 已绰绰有余，低于离体泄漏压力 (102.94 ± 15.6 cmH2O)。在体内研究中，具有血流和体温的重要组织可能影响了密封剂的性能。特别是，由于血液中的凝血因子，纤维蛋白封闭剂可以牢固地锚定在胸膜缺损处。此外，与切除的猪肺相比，由心跳和呼吸引起的肺运动可能导致密封剂的应用不均匀。ApGltn 密封胶情况下的耐压值有些不同。由于在2个耐低压情况下密封剂从密封剂的薄区域脱落，密封剂的不均匀性可能导致性能不佳和结果的可变性。
用于防止漏气的理想密封剂应具有高粘合强度和顺应性，以在充气和放气期间适应肺表面。通过喷雾装置施加的 ApGltn 密封剂为 30 毫米方形，一侧为 1 毫米厚度，符合超过 2.9-折叠到肺的扩张，而纤维蛋白密封剂符合 1.4 倍，如之前的报告中所述。此外，ApGltn 密封剂倾向于沿缺损边缘开裂，而纤维蛋白密封剂从缺损处大量剥落在密封剂外面并滑过肺表面。由于 ApGltn 具有高顺应性，在充气和放气过程中可以容纳肺表面，因此它往往会在压力最大的胸膜缺损处破裂。另一方面，纤维蛋白密封剂由于其低适形性而不能适应肺表面。我们认为 ApGltn 密封剂的高粘合强度和高顺应性有助于其在胸膜表面的高粘合质量。
此外，组织学发现显示 ApGltn 密封剂与肺实质和周围胸膜表面紧密粘附。这一组织学发现与 ApGltn 密封剂的耐高压性相符。另一方面，纤维蛋白密封剂在组织学上与肺表面分离。推测纤维蛋白密封剂在试样块的解剖过程中由于剪切力而从表面脱离，这间接表明粘附可能不紧密。
必须承认这项研究的一些局限性。首先，体内评估仅在急性期进行。因此，未评估延迟漏气的风险。在临床试验之前，我们将进行慢性期实验，以评估 ApGltn 密封剂的长期性能。其次，漏气的情况仅来自胸膜圆形缺损，这可能与临床情况不同。应在即将进行的临床试验中评估 ApGltn 密封剂对更实际情况的有效性，例如沿着缝合线撕裂。
总之，ApGltn 密封剂在使用新喷雾系统的体外和体内漏气模型中均显示出高粘合强度。此外，ApGltn 密封剂在充气和放气过程中具有足够的贴合性以适应猪肺表面，使其适合并有效地用于密封肺漏气。ApGltn 密封剂可能有助于防止肺切除期间的空气泄漏，这可能有助于减少并发症和住院时间。
翻译及审校：孙铧 张滢
图 1. 带有同心圆形出口的新型喷涂装置
(A) 喷头示意图。(B) 喷嘴的前视图。
4S-PEG 溶液从装置的中心孔 (I) 喷出。从中心孔外的中间环形出口（II）喷射癸基改性的阿拉斯加狭鳕衍生明胶。从最外面的环形出口（III）喷射空气。
4S-PEG：四臂交联剂，季戊四醇聚（乙二醇）醚四琥珀酰亚胺戊二酸酯。
图 2. 体内实验中胸膜缺损的产生
创建了一个直径为 10 mm、深度为 1 mm 的浅表均匀圆形胸膜缺损。
(B) 使用新的喷涂系统喷涂阿拉斯加狭鳕衍生明胶 (ApGltn) 密封剂。它被染成蓝色以提高能见度。
图 3. 体外抗压试验
在离体实验中，阿拉斯加狭鳕衍生明胶（ApGltn）密封剂组的泄漏压力显着高于纤维蛋白密封剂组和无密封剂组。方框的上下边界代表上下四分位数。中间的水平线代表中位数。十字代表平均值。晶须显示不包括异常值的最小值和最大值。**p < 0.01，无密封剂对比纤维蛋白封闭剂对比 ApGltn 封闭剂。
图 4 体内抗压试验
在体内实验中，阿拉斯加狭鳕衍生明胶（ApGltn）密封剂的泄漏压力显着高于纤维蛋白密封剂。方框的上下边界代表上下四分位数。中间的水平线代表中位数。十字代表平均值。晶须显示不包括异常值的最小值和最大值。*p < 0.05，纤维蛋白密封剂对比 ApGltn 密封剂。
图 5. 纤维蛋白密封剂和阿拉斯加狭鳕衍生明胶 (ApGltn) 密封剂的泄漏图像
(A) 覆盖胸膜缺损 (白色箭头) 的纤维蛋白密封剂从密封剂 (黑色箭头) 的外边缘剥落并滑过肺表面。从密封剂和肺表面之间的间隙确认了气泡（黑色箭头）。
(B) ApGltn 密封剂断裂，从沿胸膜缺损边缘的裂缝（白色箭头）确认气泡（黑色箭头）。
图 6. 肺表面密封剂的组织学发现：(A) 纤维蛋白密封剂，Elastica van Gieson 染色；(B) 阿拉斯加狭鳕衍生明胶 (ApGltn) 密封剂，Elastica van Gieson 染色
(A) 在纤维蛋白密封剂组（原始放大倍数×100）中，密封剂与缺损（白色箭头）和胸膜（黑色箭头）表面之间观察到间隙（S = 密封剂；T = 组织）。(B) ApGltn 密封剂紧紧地粘附在缺损（白色箭头）和胸膜（白色箭头）上（原始放大倍数 ×100。）（S = 密封剂；T = 组织）。
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