体外诊断原料核苷酸的修饰原理及应用
信使RNA (mRNA)于20世纪60年代首次被科研人员发现，但其不稳定性和免疫原性等问题严重阻碍了mRNA疗法的发展。为解决此类问题，科研人员研究了许多mRNA修饰策略。其中，较为重要的发现之一就是核苷酸修饰，而含有各种修饰核苷酸的mRNA，可以有效降低mRNA的免疫原性，抑制先天免疫激活，使mRNA成为了再生医学、疾病治疗和细胞重编程的有力工具。
许多证据表明，mRNA疗法相对于其他疗法，具有更大优势，包括：
1、mRNA无需进入细胞核即可发挥功能。
到达细胞质中，mRNA便可启动蛋白质翻译。相反，DNA需要先入核完成转录，生成的mRNA需出核后才能发挥功能，因此DNA的效率低于mRNA。
2、更高的安全性。
与病毒载体相比，mRNA不会整合到基因组，而只是瞬时表达编码蛋白，因此，具有更高的安全性。
3mRNA可直接通过体外转录（IVT）过程合成。
该过程相对简单、成本较低，可快速应对多种突发疾病。
体外转录mRNA的自身免疫原性是不容忽视的问题，外源性RNA可被视为病毒感染的信号。核苷酸化学修饰策略可以降低免疫原性而不影响其翻译特性，例如，天然腺苷替换为N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）；天然胞苷替换为5-甲基胞苷（m5C）；天然尿苷替换为5-甲氧基尿苷（5moU）、N1-甲基-假尿苷（m1ψ）、假尿苷（ψ）等。其中，N1-甲基-假尿苷（m1ψ）、5-甲氧基尿苷（5moU）以及假尿苷（ψ）备受关注，因为无论是体内还是体外实验都表明，它们在有效降低mRNA免疫原性的同时，也显著提高了其翻译效率。
图1 mRNA的多种化学修饰
修饰性核苷酸简介
Pseudo-UTP (Ψ)
假尿苷（Pseudouridine）是70年前发现的第一个修饰的核糖核苷酸，它是由尿苷通过碱基异构化反应而衍生的，其中核碱基围绕N3-C6轴旋转180°，导致核碱基-糖键发生变化（从N1-C1' 键变为C5-C1'键），由此产生的C-C键允许核碱基更自由地旋转。假尿苷可以像尿苷一样与腺苷进行碱基配对，但假尿苷可以通过改善碱基配对、碱基堆叠和主链稳定性来改变RNA结构。2005年，Katalin Karikó等人发现将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低。2008年，Katalin Karikó等人还发现用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力。
图2 假尿苷和N1-甲基-假尿苷结构图
N1-Methylpseudo-UTP (m1Ψ)
N1-methyl-pseudouridine是一种甲基假尿苷，一种N1修饰的假尿苷衍生物，这是一种在18S rRNA 和许多生物体中的tRNA中发现的天然修饰。N1-甲基-假尿苷在N1位有一个甲基基团，从而消除了额外的氢键供体。假尿苷和N1-甲基-假尿苷具有一个关键的共同特征，即C5-C1'键，它使核碱基和糖部分之间能够旋转，并可能有助于改善碱基配对、碱基堆叠和双链稳定性。与尿苷相比，N1-甲基-假尿苷与A配对具有更高亲和力，并且不太可能激活PKR，从而更有效地翻译，而且在结构上与假尿苷相似的N1-甲基-假尿苷也可能使mRNA能够逃避免疫反应。2015年，Oliwia Andries等人发现用N1-甲基-假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力。
N6-Methyl-ATP（m6A）
早在20世纪70年代，科学家们就在RNA中发现了m6A修饰，m6A是大多数真核生物中mRNA和长链非编码RNA最丰富的内部修饰。2012年，科学家们的研究表明，m6A 修饰和mRNA的稳定性、剪接加工、翻译有关。2018年，Shinichiro Akichikade等人还发现m6A可促进mRNA的翻译。
图3 mRNA中m6A修饰的功能示意图
5-Methyl-CTP（m5C）
5-甲基胞嘧啶（m5C）已在各种代表性生物的mRNA、rRNA和tRNA中发现。作为可逆的表观遗传修饰，m5RNA的C修饰会影响修饰后的RNA分子的命运，包括促进mRNA稳定性、剪接和核质运输；病毒蛋白表达；DNA损伤修复；mRNA 稳定性；细胞耐受性、增殖和迁移；干细胞的发育、分化和重编程。此外，m5C的分布因细胞类型而异。在mRNA的特定位置上的m5C修饰表现出不同的调控活性。
图4 蛋白质介导m5C修饰示意图
m5C修饰主要有3类蛋白质介导，分别是甲基化转移酶（methyltransferases, writers）、去甲基化酶（demethylases, erasers）、结合蛋白（binding proteins, readers）。
5-Methoxy-UTP（5moU）
5-甲氧基尿苷（5moU）是一种罕见的核苷，RNA（mRNA）中加入5-甲氧基尿苷可以降低所得mRNA的免疫原性。2022年，Hanieh Moradian等人发现尿苷的化学修饰，特别是5-甲氧基尿苷，显示出最高水平的蛋白质产生，而对炎性巨噬细胞反应的诱导可忽略不计。
图5 5moU促进mRNA表达
Cyanine 5-UTP （Cy5-UTP）
Cyanine 5-UTP（Cy5-UTP）可以替代UTP作为T7 RNA聚合酶的底物，通过体外转录产生标记探针。组装后的mRNA会在Cy5-UTP的参与下发出橙色荧光。该荧光探针可以通过小动物活体成像技术应用于mRNA在动物体内的分布研究。此外，凝胶电泳后Cy5标记的mRNA在紫外线下很容易看到，无需进一步染色。这些方法产生的探针适用于各种应用，如FISH，多色荧光分析，特别是与Cy5-UTP结合的双色表达阵列。
图6 Cy5-UTP结构式
修饰核苷酸经典应用案例
N1-甲基-假尿苷在COVID-19 mRNA疫苗中的作用
Pfizer-BioNTech和Moderna Therapeutics于2020年开发了两个基于mRNA技术的新型疫苗平台（分别是comirnaty?和spikevax?），并且是第一个功效高于90%的疫苗平台。两者均由编码SARS-COVID-19 Spike蛋白的N1-甲基-假尿苷修饰的mRNA组成，并采用脂质纳米颗粒（LNP）制剂递送。
图7 N1-甲基-假尿苷-修饰的COVID-19 mRNA疫苗
由于核糖核酸的递送问题几十年来一直困扰着人们，LNP的成功很快被许多人誉为COVID-19 mRNA疫苗的无名英雄。然而，Curevac mRNA疫苗（CVnCoV）的临床试验疗效结果表明，递送系统并不是成功的唯一重要因素。CVnCoV由未经修饰的mRNA组成（编码与Moderna和Pfizer-BioNTech的mRNA疫苗相同的刺突蛋白），并采用与Pfizer-BioNTech的疫苗（Acuitas ALC-0315）相同的LNP 配制，然而其功效仅为48%。疗效上的这种显著差异可归因于Pfizer-BioNTech和Moderna的mRNA疫苗（CVnCoV中没有）中存在关键的RNA修饰（N1-甲基-假尿苷）。
图8 SARS-COVID 19 mRNA 疫苗接种示意图
N1-甲基-假尿苷代替常规的UTP，可以减少生成的mRNA的免疫原性，提高mRNA的表达。人体细胞含有多种模式识别受体，这些受体能够识别病原RNA并激活下游信号通路做出反应，例如胞内体受体TLR3、TLR7和TLR8，识别双链和单链RNA；胞浆受体RIG-I和MDA-5，识别双链和5'-三磷酸修饰的RNA。mRNA疫苗的目的是先生产出抗原蛋白再激活相应免疫反应，如果mRNA在没有翻译成抗原蛋白前就诱导强烈的免疫反应，可能会抑制抗原的表达从而降低疫苗的有效性，甚至有可能会出现过敏反应伤害人体。
图9 N1-甲基-假尿苷修饰降低合成mRNA的免疫原性
总的来说，众多研究表明使用一些特殊修饰核苷酸生产的RNA更安全，有效性更高。使用N1-甲基-假尿苷生产的mRNA能够在减少mRNA免疫原性和提升mRNA的翻译效率这两方面极大的提高mRNA的有效性。