细胞致死肿胀毒素受体基因Tmem181在小鼠发育中的表达研究
细胞致死肿胀毒素受体基因Tmem181在小鼠发育中的表达研究
羊雪芹*，霍苏曼*，王 敏，房郁坤，朱晓静
杭州师范大学生命与环境科学学院浙江省器官发育与再生技术研究重点实验室，浙江 杭州 311121
*具有同等贡献
摘 要
Wnt信号通路对胚胎早期发育、器官形成和组织再生等都有重要调控作用.TMEM181是细胞致死肿胀毒素受体，含有1个WNT蛋白结合域.全胚胎原位杂交结果显示，Tmem181在小鼠胚胎发育E7.5时期有大量表达，随后主要表达于第一、第二鳃弓和肢芽中.组织切片原位杂交结果显示，Tmem181在小鼠胚胎颅面部组织中的舌、牙齿和腭板的上皮和间充质，以及舌肌肉中均有表达；Tmem181在小鼠胚胎脑组织中有大量表达.定量PCR结果显示，Tmem181在成年小鼠的脑、心脏、肺脏、肝脏和肌肉组织中有表达.Tmem181在小鼠胚胎发育中的表达位置和Wnt信号通路活性部位密切相关，TMEM181具有WNT蛋白结合结构域，提示TMEM181在胚胎发育中的作用可能和Wnt信号通路功能相关.
关键词
Tmem181；小鼠；发育；颅面部器官；脑
引 言
Wnt基因最早在小鼠乳腺癌模型中被发现，其编码一类分泌型蛋白WNT.哺乳动物和果蝇中的WNT蛋白具有高度保守性，含有多个保守的半胱氨酸残基，并且都具有棕榈酰转移酶结合区域.Wnt信号通路主要包含经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路.在由β-Catenin介导的经典Wnt信号通路中，配体蛋白WNT与膜受体Frizzled和辅助受体LRP5/6结合，抑制GSK3β、APC、AXIN等蛋白组成的降解复合体的形成，使细胞质中β-Catenin进入细胞核并与TCF/LEF家族的转录因子结合，进而调控下游靶基因的转录.研究表明，Wnt信号通路调节细胞增殖、凋亡、迁移和分化，在胚胎发育、器官发生和组织稳态方面具有关键的调控作用.Wnt信号转导异常可造成某些先天性疾病.以Wnt配体基因突变为例，Wnt1纯合突变小鼠在胚胎发育过程中死亡、中脑和小脑发育严重异常，Wnt2敲除小鼠发生胎盘发育缺陷，小鼠Wnt3缺失可导致体轴形成失败，Wnt3a敲除小鼠体节缺失、脊索及中枢神经系统发育异常，小鼠Wnt9b或Wnt5a缺失均可导致腭裂，人类WNT5A和WNT9B等WNT基因突变也可导致唇腭裂等颅面部器官发育缺陷.此外，Wnt信号通路基因表达异常也和乳腺癌、肠癌、胃癌和前列腺癌等肿瘤的发生和发展密切相关.
TMEM181又名GPR178，是一种G蛋白偶联受体( GPCRs)，介导致病菌分泌的细胞致死肿胀毒素( CDT)反应.目前关于TMEM181的研究报道较少，其潜在功能尚不清楚.采用BLASTP进行蛋白结构分析发现，TMEM181含有WNT结合结构域，提示TMEM181的功能可能与Wnt信号通路相关.本研究分析Tmem181在小鼠发育中的表达情况，观察其表达部位是否和WNT活性部位相关，为进一步研究TMEM181在哺乳动物颅面部形态发生和器官发育过程中的分子机制提供基础.
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材料和方法
1.1 实验动物
选用健康的C57BL/6小鼠(购于杭州师范大学实验动物中心)，体质量为25～30g.实验小鼠饲养于杭州师范大学实验动物中心无特定病原体(SPF)环境，雌雄交配后每日7:00—9:00检栓，阴栓检测阳性视为交配成功，同时记录为E0.5 (embryonic day 0.5)，收取E7.5—E14.5各时期孕鼠.小鼠出生当天记录为P0(postnatal day 0)，收取P40成体鼠.小鼠的饲养和使用受到杭州师范大学实验动物福利与伦理委员会的监督，伦理审批号为HSD20150101.
1.2 探针质粒构建及探针合成
将小鼠Tmem181a基因的转录本(transcript variant 1) mRNA的22～549bp片段克隆到pGEM-easy线性化载体中，测序鉴定后用RNA探针合成试剂盒(Roche，美国)合成探针.
1.3 原位杂交
1.3.1小鼠全胚胎原位杂交
收集E7.5—E12.5小鼠全胚胎样品，使用4%多聚甲醛固定.蛋白酶K处理后，杂交液封闭，加入探针于杂交液孵育过夜.漂洗后，加入抗地高辛抗体孵育过夜.样品在室温中避光显色，使用PBST终止反应后，于体视镜下拍照观察.
1.3.2小鼠组织切片原位杂交
小鼠胚胎样品经4%多聚甲醛固定过夜后，酒精梯度脱水、过蜡、切片，切片厚度为12μm.组织切片经蛋白酶、乙酸酐处理，杂交液封闭等一系列处理后，加入地高辛标记的Tmem181反义RNA探针孵育过夜.经抗地高辛抗体孵育后，加入底物显色，采用PBS缓冲液终止反应.随后，对组织切片使用伊红对染，经树脂封片后，于显微镜下观察拍照.
1.4 实时定量PCR
采用RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen，美国)分别提取P30小鼠脑、心脏等组织总RNA，取1 μg RNA进行反转录获得cDNA.设计小鼠Tmem181特异定量引物，正向引物序列：5’-TGCCTGCTAATTATTCACTCAA-3’，反向引物序：5’-AGGGCTCCAGCTCCACAAC-3’.以cDNA为模板进行实时定量PCR，扩增结果采用管家基因ACTB进行校正.
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结果与分析
2.1 Tmem181在小鼠胚胎中的表达
Tmem181在多种生物中高度保守，编码小鼠TMEM181的基因是Tmem181a，本文所指小鼠Tmem181基因为Tmem181a.本研究采用Tmem181特异性探针对E7.5—E12.5小鼠进行全胚胎原位杂交.结果显示，在E7.5，Tmem181在胚胎整体部位均有表达(图1A).在E8.5，Tmem181在整胚有表达，于神经管处强表达(图1B).在E9.5—E10.5，Tmem181的表达集中在第一、第二鳃弓，以及肢芽(图1).这些定位结果与Wnt信号表达位置高度重合，提示TMEM181和Wnt信号通路可能存在联系.
探针信号为紫色；nt:神经管；hl:后肢芽；fl:前肢芽；ba:鳃弓. A—B比例尺:500μm；C—F比例尺:1mm.
图1 小鼠胚胎发育过程中Tmem181的全胚胎原位杂交图
2.2 Tmem181在小鼠胚胎颅面部的表达
为进一步研究Tmem181在颅面部各个器官组织中的表达，本研究对小鼠胚胎不同时期石蜡样品进行冠状面切片，并采用Tmem181特异性探针进行原位杂交.结果显示，E11.5—E14.5，在牙齿发育中Tmem181主要在表皮表达，在间充质也有弱表达.E14.5帽状期，Tmem181在釉节和颈环处有强烈表达.E11.5—E13.5，Tmem181在腭板、舌的表皮和间充质中有表达.E12.5—E14.5，Tmem181在舌部肌肉组织中有表达.见图2.
A—C：E11.5；D—F：E12.5；G—I：E13.5；J—L：E14.5；探针信号为紫色；p：腭板；m：磨牙；t：舌；比例尺：100μm.
图2 E11.5—E14.5小鼠胚胎颅面部组织切片Tmem181原位杂交图
2.3 Tmem181在小鼠胚胎和成年小鼠脑部的表达
小鼠胚胎期Tmem181原位杂交结果显示，Tmem181在小鼠脑部有大量表达.E11.5时的杂交信号主要在脑室(图3A)，E12.5时Tmem181在脑室区均匀表达(图3B)，E14.5时Tmem181在脑室区呈点状分布(图3C)，提示Tmem181在小鼠脑发育中可能发挥重要作用.收集成年小鼠(P40)的肺、肝、大脑、肌肉等组织进行定量PCR，分析Tmem181在小鼠成体组织中的表达情况，结果显示，Tmem181在成体小鼠心、肺、肝脏、肌肉、脑组织中均有表达，在脑组织中有强表达(图3D).
探针信号为紫色；A—C：小鼠胚胎脑部组织Tmem181原位杂交结果；D：P40小鼠组织Tmem181定量表达结果；比例尺：200μm.
图3 小鼠脑部组织Tmem181表达分析
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讨论
Wnt信号通路对哺乳动物器官的形态发生、组织分化和功能成熟有重要的调节作用.在胚胎发育早期和器官发育的多种组织中都可以检测到Wnt信号通路基因的表达和Wnt信号通路活性的存在.多种Wnt信号通路拮抗剂和配体在胚胎神经发育早期就具有特定的时空表达模式，在神经系统发育特别是脑组织发育中具有重要调节作用.TMEM181和Wnt配体的分泌调控蛋白GPR177都具有WNT结合结构域.GPR177在体轴形成和器官发育中非常重要，Gpr177早在胚胎发育的E6.25就有表达；E9.5,在颅面部突起处可以检测到Gpr177的表达.随着颅面发育的进行，Gpr177在腭板上皮和间充质细胞中均有表达，在牙齿发育过程中的口腔和牙齿上皮、间充质也有强烈表达.此外，Gpr177在小鼠胚胎舌上皮组织中也有强烈表达.和Gpr177类似，多种Wnt配体和Wnt信号通路基因在这些组织中也有不同的时空表达.在小鼠中全敲除Gpr177可导致小鼠胚胎原条和中胚层发育异常并引起胚胎早期死亡.而在不同组织中，条件性敲除Gpr177会引起Wnt信号通路活性的降低，并且产生各种发育缺陷型，比如颅面发育畸形、腭裂、牙齿发育和分化问题、味蕾发育异常、小鼠肢芽发育异常等.本研究结果显示，小鼠胚胎发育中Tmem181基因的表达与Wnt信号通路相关因子表达高度重合.TMEM181具有1个WNT蛋白结合域，由此提示TMEM181在机体发育中的功能可能和Wnt信号通路相关.
TMEM181是G蛋白偶联受体之一，在脊椎动物和昆虫中均高度保守.系统发育分析显示，脊椎动物与人类的TMEM181氨基酸同源性超过70%.细胞实验结果显示，Tmem181突变体对CDT具有抗性，在NIH3T3细胞、U2OS细胞和Hela细胞中过表达Tmem181，可使这些细胞对CDT中毒敏感.GeneCards数据库信息显示，TMEM181表达紊乱与生殖器感染疾病软下疳以及Ⅰb型生长激素缺乏症相关.患病家族全基因组分析结果显示，TMEM181是儿童和成人龋齿的基因连锁位点.这些数据显示TMEM181和人类遗传疾病密切相关，本研究结果为进一步研究TMEM181在哺乳动物发育中的功能提供数据.
通信作者
羊雪芹，女，实验师，硕士，主要从事小鼠显微操作和颅面器官发育研究.
原文刊载于：
《杭州师范大学学报(自然科学版)》2022年第5期
为方便阅读，以上内容有删减。