优先发表不同抗凝监测指标与心脏术后患儿体外膜肺氧合期间肝素浓度的相关性
体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）越来越多地应用于心脏围手术期，以防患者无法脱离体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）[-]。这可以为决策、康复、长期机械支持或移植提供桥梁。虽然丰富的经验、完善的治疗策略和技术进步都有助于提高 ECMO 救治的存活率，但出血及血栓形成仍然是 ECMO 中最常见的并发症，其导致相当高的合并症发病率和死亡率[-]。由于血液和人工回路之间的相互作用会导致患者出现主要由凝血酶介导的促炎和高度促凝状态，这一状态被纤溶酶介导的持续纤溶状态所抵消[]。这种平衡在儿童中尤其具有挑战性，因为其凝血因子、促凝因子、抗凝因子水平是随年龄不断改变的[-]。此外，先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是该患者群体中血栓形成的危险因素；在 ECMO 患者血栓形成和出血的临床预测因素的相关研究[]中，尸检时发现 CHD 患者血栓发生率明显高于心脏解剖正常的患者。
因此，需要治疗性抗凝治疗，以预防血栓事件，维持 ECMO 回路的通畅，同时最大限度地降低患者的出血风险。虽然，不同 ECMO 中心对儿童的具体抗凝做法差异很大，普通肝素（unfractionated heparin，UFH）由于起效快、低成本、半衰期短、可逆性好以及使用经验丰富，在 ECMO 回路中仍是应用最广泛的抗凝药物。UFH 的作用依赖于与抗凝血酶（antithrombin，AT）和肝素辅因子Ⅱ形成复合物来抑制活化的Ⅹ因子和凝血酶；另外，由于 UFH 带负电，它与带正电的血浆蛋白非特异性结合，导致抗凝作用不稳定[]。UFH 的缺点包括基于疾病严重程度的药代动力学改变、肾功能衰竭和新生儿分布容量的增加[]。患者对固定剂量的反应不同部分归因于肝素结合蛋白，以及随后 UFH 的抗凝活性降低。由于 UFH 需要特定的多糖序列才能与 ATⅢ结合，生产批次之间的活性也存在差异，这可能有助于解释不同的个体反应。因此对 UFH 的监测也显得尤为重要。
尽管体外生命支持组织（Extracorporeal Life Support Organization，ELSO）的抗凝指南强烈建议在没有禁忌证的情况下，进行抗凝治疗，但指南既未指定抗凝的目标强度，也没有就首选监测策略达成共识。鉴于 ECMO 导致的生理改变可能会影响抗凝监测的结果和解释[-]。如由于凝血因子的消耗，活化凝血时间（activated clotting time，ACT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，aPTT）在 ECMO 中可能会延长[]；anti-Ⅹa 活性分析定量评估了抑制因子Ⅹa 的作用，但可能未考虑其它血液学异常[-]，ELSO 中心已采用 ACT、aPTT 和 anti-Ⅹa 活性分析用于监测抗凝状态。因此，在这项观察性研究中，我们试图评价 aPTT、ACT 以及 anti-Ⅹa 活性与心脏术后患儿 ECMO 期间UFH 输注浓度的相关性。
回顾电子病历，连续收集 2013 年 1 月—2020 年 10 月于中国医学科学院阜外医院心脏外科术后接受 ECMO 支持的患儿（年龄 6 月龄至 6 岁）的临床资料。患儿的心内畸形通过超声心动图检查确诊。排除标准：（1）术前已存在获得性和/或先天性凝血功能障碍；（2）危及生命的情况下紧急手术；（3）ECMO 运行时间短于 24 h；（4）以前被诊断为肝素诱导的血小板减少症；（5）对 UFH 过敏；（6）在 ECMO 运行期间采用 UFH 以外的抗凝剂；（7）患者在 ECMO 期间未开始肝素滴注；（8）安装的 ECMO 类型为静脉-静脉体外膜肺氧合（VV-ECMO）。
我院心脏术后患儿均采用中心插管的方式安装静脉-动脉体外膜肺氧合（VA-ECMO）。患儿是否需要安装 ECMO 由外科、体外循环科以及儿科重症室（pediatric intensive care unit，PICU）医生评估后决定。
ECMO 系统由离心泵（Jostra，Maquet Inc.，Rastatt，Germany）、膜氧合器（Hilite 800/2400L TTM，Medos Medizintechnik AG，Stolberg，Germany；Quadrox PLS? MAQUET Cardiovascular，Hirrlingen，Germany；Sorin，Italy）、热交换器和聚氯乙烯管组成。
在 ECMO 支持期间，每班次都要进行血栓评估，并且记录回路中的血栓形成情况。记录血栓的大小、位置、活动性和颜色。PICU 医生与体外循环科医生对血栓的风险进行评估，并确定是否应进行回路干预。回路干预包括氧合器更换、动脉管路清洁/更换、接头清洁/更换以及插管清洁/更换。
在 ECMO 支持期间，每天评估胸腔引流管（胸管）和插管部位的出血情况。如果患者有明显的活动性出血，包括胸管引流量突然增加、输血后血红蛋白浓度持续下降或血流动力学不稳定，则由外科主治医生开胸探查以确定出血部位。经 ECMO 团队评估后，作为抗凝方案的一部分，在出血期间，应减少 UFH 的输注剂量甚至停止 UFH 输注，直到连续 2 h 胸腔积液量<5 mL/（kg·h），需要时，进行相应的止血干预并输注相应的血制品。
ECMO 系统使用晶体溶液 Plasma-Lyte A 预充（PLA，Baxter Healthcare，Deerfield，IL，USA）。另外，根据患者需要使用 20% 人血清白蛋白、红细胞、新鲜冰冻血浆和碳酸氢钠。
自 2017 年以来，我院监测手段得到了进一步丰富和完善。除上述指标外，还添加了 anti-Ⅹa 活性分析。当临床需要时，增加 ACT 和 aPTT 检测以及其他凝血监测的频率。
安装 ECMO 后，全身肝素化的时机与 UFH 剂量的调整主要由胸管引流情况、aPTT 以及 ACT 决定。通常每 1～3 h 测量一次 aPTT 和 ACT，这两项检测均为床旁即时检测；根据主管医生需要，每天送检 1～2 次 anti-Ⅹa 活性。如果患儿是直接由 CPB 直接转换为 ECMO，则在转换为 ECMO 后，先以 1 mg∶100 U UFH 比例给予鱼精蛋白，再根据以上提及的指标决定全身肝素化的时机与调整 UFH 剂量。
ECMO 运行期间出血风险很高。为了最大限度地减少出血并发症，我们推迟了全身肝素化。在条件稳定、胸腔引流量明显减少的情况下，开始小剂量［2～10 U/（kg·h）］UFH，并逐渐增加。aPTT 和 ACT 的目标范围分别为 50～80 s 和 140～220 s。
输血阈值并不固定。正常情况下，输注红细胞以达到 30% 的目标红细胞压积。当血小板计数<50×109 /L 时输注血小板，输注新鲜冰冻血浆补充凝血因子。阿加曲班用于肝素诱导的血小板减少症。
出血事件定义为临床上与血红蛋白在 24 h 内下降 2 g/dL，在 24 h 内输注红细胞>10 mL/kg，关键部位（中枢神经系统，腹膜后或肺部）的出血，或严重到需要手术治疗的事件相关的明显出血。如果连续几天的主要出血来源与前几天相同，则认为是相同的出血事件。当 1 例患者在同一天有 1 个以上的出血源时，也需要记录下来。
血栓形成事件被定义为任何发生于静脉或动脉的全身性血栓栓塞事件，或者氧合器或回路中存在需要替换 ECMO 回路的血凝块。
以上两个定义均来自 ELSO 抗凝指南[]。因为很难回顾性辨别出血事件开始的确切时间，我们评估了在病历表中首次记录出血事件之前和之后8 h 的凝血数据。对于血栓事件，我们评估了从 ECMO 开始至检测到血栓的凝血数据。
采用 Shapiro-Wilk 检验对小样本的连续变量进行正态性检验，若计量资料符合正态分布，则以均数±标准差（±s）表示，若不符合，则以中位数（上下四分位数）［M（P25，P75）］表示。计数资料用例数（%）表示；正态分布数据组间比较采用 t 检验，非正态分布数据组间比较采用 Mann-Whitney U 检验；采用 χ2 检验比较计数资料。
采用 Pearson 相关系数评估同一患者同时测定的 ACT、aPTT 或 anti-Ⅹa 活性与相对应的 UFH 之间的相关性；并且，UFH 剂量为 0 U/（kg·h）相对应的 ACT、aPTT 以及 anti-Ⅹa 活性被排除在分析之外。应用 R 软件（版本号：3.6.3，http://www.R-project.org）以及 SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计分析，双侧P≤0.05为差异有统计学意义。
本研究已通过中国医学科学院阜外医院伦理委员会审批，批准号：2017-977。
根据本研究的纳入与排除标准，共纳入 58 例患儿进行统计分析，31 例患儿在 CPB 结束时于手术室直接从 CPB 过渡至 VA-ECMO，27 例患儿在返回 PICU 后因心脏骤停或低心排血量综合征，在复苏过程中，于 PICU 启动 VA-ECMO。
在研究期间，4 例患儿被排除，原因如下：ECMO 运行时间<24 h（3 例，均由于家属放弃治疗，患儿自动出院），以及在 ECMO 运行期间采用 UFH 以外的抗凝剂（1 例）。根据 ECMO 期间是否出现出血事件将患者分为出血组（n=39）和非出血组（n=19）。
两组患儿术前以及术中的临床资料见。单因素分析显示出血组的患儿术前 aPTT 较非出血组患儿长（P=0.011），然而两组间其平均数仅相差 1.60 s，并不具有临床意义。两组患儿性别、年龄以及体重差异无统计学意义（P>0.05），说明两组患儿具有可比性。
两组患儿安装 ECMO 后及住院期间临床特征见。单因素分析显示，与非出血组患儿相比，出血组患儿在安装 ECMO 当日的红细胞计数（P=0.049）、血红蛋白浓度（P=0.010）以及红细胞比容（P=0.046）均较低。住ICU期间，出血组患儿的新鲜冰冻血浆（P=0.034）以及纤维蛋白原（P=0.033）的输注量较多，但两组间红细胞、血小板、白蛋白以及人凝血酶原复合物输注量差异无统计学意义（P>0.05）。两组患儿的机械通气时间、ECMO 时间、住 ICU 时间以及总住院时间差异无统计学意义（P>0.05）。
与出血组患儿相比，出血组患儿开胸探查止血的比例较高（P=0.000）；而两组间的呼吸道出血、胃肠道出血、血栓事件、二次手术以及死亡事件的患者比例差异无统计学意义（P>0.05）；见。
分别绘制 ACT、aPTT、anti-Ⅹa 活性与 UFH 的散点图；见～。结果表明 ACT、aPTT 与 UFH 之间均不存在线性相关性；然而，anti-Ⅹa 活性与 UFH 存在中等程度相关（r=0.418，P=0.013）。
凝血系统异常是 CHD 围术期普遍存在的问题，甚至在新生儿期亦可以出现[]。儿童发育对凝血系统的影响也可能是体内肝素浓度与相应的抗凝监测指标之间存在差异的原因之一。与正常的适龄儿童相比，CHD 患儿通常表现出诸多促凝血因子和抗凝血因子水平的降低，包括因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ、蛋白 C、蛋白 S、纤维蛋白原和抗凝血酶，并且，这些因子在较晚的年龄才达到与成人相当水平[-]。CHD 患儿凝血系统成熟延迟或不均衡，可能导致促凝因子和抗凝血因子失衡，增加血栓形成的风险。CHD 患儿血栓发生率增加的另一个可能是心脏手术导致血栓形成。如由于正中胸骨切开或长时间手术而导致的CPB、循环骤停或组织因子释放，可能会导致全身血栓的发生率上升。此外，部分患者接受人工材料作为矫正手术的一部分；也许凝血系统对人工材料的反应会增加血栓的发生率；因此，抗凝治疗对于CHD术后接受 ECMO 支持的患儿至关重要。
UFH 的抗凝作用取决于血浆性质以及肝素浓度，并且在患者之间有所不同。肝素在不同患者中的生物活性可能短至 30 min 或长达 6 h。通过生物测定法直接监测循环肝素的浓度表明，ACT、aPTT、anti-Ⅹa 在反映抗凝状态方面有所不同。然而，在 ECMO 支持的患儿中抗凝是一个复杂的过程，抗凝监测方法也远不理想[]。
我们发现在接受 VA-ECMO 治疗的患儿中，ACT、aPTT 与肝素剂量不存在相关性，表明 ACT、aPTT 不是反映这些患者肝素效应的可靠指标。aPTT 是一种基于血浆的测试，反映了凝血级联反应的内在途径和共同途径的功能。其考虑了纤维蛋白原水平对凝块形成的贡献，但 aPTT 是在没有血小板和红细胞的环境中检测所得的，这可能会影响凝血时间和对 UFH 的反应[]。aPTT 在患者内和患者间的变异性很大，特别是在儿童患者中，这可能有助于解释 ECMO 患儿的 aPTT 和 UFH 之间的不一致。此外，ACT 具有易于使用、周转快和多年的 ECMO 管理经验等优点。它考虑了 UFH 对凝血影响的因素，包括：温度、pH、钙水平、纤维蛋白原水平、血小板计数和红细胞，提供了一种更“生理”的方法来衡量 ECMO 患者在“体外”环境下凝块形成的时间和 UFH 的影响。然而，它并不仅仅代表 UFH 效应，也不能够区分上述因素的相对贡献。因此，它不能用来纠正导致血栓形成的各种因素。研究[]表明，在CPB期间，ACT 与血浆肝素水平的相关性很差，部分原因是由于血液稀释和贫血，这两种情况也都在 ECMO 期间发生。结果在我们的研究中也同样证实，在通常用于 ECMO 的剂量范围内，ACT 与 UFH 的相关性很差[-]。这可能导致更高剂量的肝素输注和更高的总出血量。
Anti-Ⅹa 活性检测是一种显色试验，ECMO 患者的胆红素和游离血红蛋白经常升高，这可能会产生偏差。在抗凝血酶值较低的情况下，这项检测也可能低估了 UFH 的效果。更重要的是，anti-Ⅹa 活性检测是一种基于血浆的检测，它没有考虑血小板和纤维蛋白原在形成稳定凝块中的作用。血小板减少和血小板功能障碍是 ECMO 患者的共同特征，低估它们的作用可能会导致过度抗凝。相反，纤维蛋白原是一种急性期蛋白，一些患者在 ECMO 支持期间可能会出现高水平纤维蛋白原的情况。在这种情况下，基于 anti-Ⅹa 活性的 UFH 监测并不敏感，尽管它可能与血栓并发症有关。最后，根据非 ECMO 患者治疗和预防血栓事件所制定的理想范围（0.3～0.7 IU/mL）应用于 ECMO 患者是武断的。此外，在 34 例接受 ECMO 治疗的患儿中，Bembea 等[]发现 ACT、aPTT 与 anti-Ⅹa 活性水平之间均无相关性。这些结果引发了临床医生对仅使用 anti-Ⅹa 活性指导 ECMO 抗凝的担忧。这种不可靠性的潜在原因包括内源性凝血系统内部的差异，人群之间疾病状况的变化，是否使用肝素涂层的 ECMO 回路以及使用不同的 ACT 检测装置或激活剂的差异[, ]。另外，值得注意的是，主管医生使用 anti-Ⅹa 活性分析接受 ECMO 治疗的患儿的抗凝程度，还应该知道其所处机构的 anti-Ⅹa 活性检测时是否使用外源性 AT。特别是在新生儿和儿科患者中，使用外源性 AT 的检测不太可能准确反映体内肝素的状况，因为这些患者经常会出现低水平的内源性 AT。
Anti-Ⅹa 活性检测被认为是其他患者人群肝素管理的金标准，其通过检测 UFH-ATⅢ复合物的水平来评估肝素抗凝效果。正如预期的那样，抗凝血因子Ⅹa 活性与 UFH 之间存在中等程度相关，表明 anti-Ⅹa 活性是患儿 VA-ECMO 中肝素效应的可靠指标。即便如此，仅肝素的输注速率不足以衡量患儿的整体抗凝程度。患儿的内源性凝血因子水平是不可预测的，因为因子水平会因年龄以及基础疾病的不同而变化。这两个因素都必须与同时输注的不同数量的血制品一起考虑。此外，患者之间肝素清除率的差异以及 ECMO 回路组件在螯合肝素中发挥的未知作用进一步限制了肝素输注速率作为衡量患者之间抗凝程度的效用。不仅如此，在 ECMO 期间常规使用 anti-Ⅹa 活性监测凝血功能是受限的。首先，目前还不能在床旁测量 anti-Ⅹa 活性。第二，anti-Ⅹa 活性的检测时间受限，我们机构的 anti-Ⅹa 活性检测仅能在周一至周五白天进行，不能完全满足临床需求。
我们的研究集中于通过 ACT、aPTT 和 anti-Ⅹa 活性水平监测 UFH。但是，在 ECMO 期间使患者获得足够的抗凝是一个复杂的过程，肝素效应必须在肝素化开始前所产生的凝血酶和纤维蛋白量的背景下进行解释。此外，在解释肝素对患者的影响时，还应基于纤维蛋白原和血小板功能监测患者的整体凝血能力。因此，结合能够评估血小板和纤维蛋白原对凝块形成的相对贡献的全血试验，如本研究中未使用的另一种可能有价值的实验室检测方法：血栓弹力图（thromboelastograph，TEG）或类似的旋转血栓弹力图（rotational thromboelastometry，ROTEM），从而提供有关抗凝、血栓形成、血小板功能和纤维蛋白溶解的信息，进而协助主管医生做出有关肝素输注速率和血液制品或凝血因子管理的决策。TEG 和 ROTEM 在研究期间不能常规应用于临床，因此不包括在本分析中。
尽管我们目前仅使用 ACT、aPTT 和 anti-Ⅹa 活性水平来管理 ECMO 患儿的肝素输注，但我们赞成最佳的抗凝依赖于多种凝血监测全面且标准化的评估，包括 ACT、aPTT、anti-Ⅹa 活性、TEG?、AT 活性、血小板计数和纤维蛋白原浓度；并应与患者的临床凝血状态及其出血或血栓并发症的独特风险联系起来。为了更准确地评估接受 ECMO 患者的凝血状态，需要开发更精确的凝血监测方法，将高剪切应力和生物表面（如微流体模型）结合起来，以便在监测时更精确地反映抗凝和抗凝血酶水平[-]。
本研究存在的局限性在于：（1）每天只能送检 1～2 次 anti-Ⅹa 活性检测且样本量较小，限制了可用于分析的数据点的数量；（2）数据未显示anti-Ⅹa 活性与血栓并发症、出血性并发症或死亡之间的相关性。这些结果引起临床医生对目前该指标在临床实践中监测患者抗凝以及预防出血和出血性并发症能力的关注；（3）我们的队列既包括因难以脱离 CPB，于手术室内直接转换为 VA-ECMO 的患儿，又包括在复苏过程中，于 PICU 启动 VA-ECMO 的患儿，虽然这在一定程度上可以增强我们数据的外部有效性，但不同的患者群体可能会混淆一些观察到的结果；（4）作为一项单中心研究，机构间抗凝监测方案以及抗凝检测（即用于进行 aPTT 与 ACT 检测的床旁即时凝血检测仪及配套试条以及 anti-Ⅹa 活性的检测方法）的差异无法评估；以及考虑到我院接受 VA-ECMO 的患儿均为CPB下心脏术后的患儿，且安装 ECMO 的指征较为严格，从而可能会限制本研究的外部推广作用。
在我们的分析中，anti-Ⅹa 活性与 UFH 输注剂量的相关性比 aPTT 和 ACT 好。aPTT 与 ACT 在 ECMO 患儿中监测肝素化程度的作用可能仍然有限。这种相关性的缺乏突显了 ECMO 抗凝监测的复杂性，以及使用单一检测方法检测抗凝的局限性。纳入多种评估手段对于确保安全的临床实践是必要的。
利益冲突：无。
作者贡献：沈瑞环负责数据收集、分析，论文设计、撰写；王旭负责论文总体设想和设计；鲁中原、姜亚洲负责论文部分设计。