【呼吸疾病研究】肺表面活性物质蛋白C基因218位点变异致婴幼儿肺间质疾病七例临床
对象和方法
一、研究对象
该研究为回顾性研究，研究方案由广西医科大学第一附属医院制定并经该院伦理委员会批准[伦理审批号：伦审2018（KY-E-050）]，调查内容均获得家长知情同意。选择广西医科大学第一附属医院儿科、深圳市儿童医院呼吸科、苏州大学附属儿童医院呼吸科2013年1月—2016年12月收治的来自不同家系的7例（女2例，男5例）SFTPC基因218位点变异相关性ILD的患儿为研究对象。
纳入标准[3,8]：（1）以咳嗽、呼吸增快或呼吸困难、活动不耐受等为主要表现；（2）呼吸增快、三凹征或杵状指、肺部湿啰音、生长发育落后等体征；（3）低氧血症；（4）胸部X线或CT提示两肺弥漫性病变。排除标准：原发性免疫缺陷病，支气管肺发育不良，原发性纤毛运动障碍。
二、研究方法
临床资料的收集和分析：回顾性总结患儿的发病年龄、临床表现、诊疗经过、疾病转归、既往史、出生史、家族史、生化指标、病原学检查、血气分析、胸部影像学等多方面情况，通过门诊、网络或电话完成病例随诊。
基因检测及变异分析：在知情同意的前提下，采集患儿及其家属乙二胺四乙酸抗凝外周静脉血各2 ml，（1）使用DNA全自动提取仪，采用MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒提取基因组DNA，利用Ion PGM或Illumina MiSeq平台对SFTPC、SFTPB、ABCA3这3个基因的基因编码区全长及附近转录剪接位点的变异进行检测。（2）所得测序结果与UCSC数据库提供的人类基因组hg19参考序列进行比对，筛选出变异基因。通过PolyPhen软件和SIFT预测变异致病性。技术由武汉康圣达医学检验所及北京海思特临床检验所提供完成。
结果
一、7例患儿的临床资料
7例SFTPC 218位点变异的ILD患儿的主要临床特征见表1，起病年龄均在2岁以前，4例3月龄内发病，2例1岁以后发病，1例在3月龄至1岁间发病。临床上均以咳嗽、气促、发绀为主要表现，绝大多数肺部可闻及湿性啰音，伴生长发育受限，4例慢性缺氧、杵状指，3例曾诊断过"重症肺炎"，有机械通气病史。7例患儿均为足月儿，母孕期体健，无流产、无特殊用药史，否认家族中有类似疾病史，除例5家族有地中海贫血病史外，其余均否认家族中有遗传代谢疾病史。
二、辅助检查结果
7例SFTPC 218位点变异的ILD患儿的辅助检查见表2。7例患儿的外周血白细胞总数、C反应蛋白基本正常。病原学检查：3例外周血巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）-IgM或CMV-DNA阳性；所有患儿的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）、真菌检查均阴性；肺炎支原体抗体检测除例3阳性外，其余均阴性。对4例患儿进行支气管镜检查，镜下均提示支气管内膜炎症，3例患儿家属拒绝进行该项检查。血气分析示不吸氧情况下动脉血氧分压在50~65 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。2例（例2、例5）心脏彩色多普勒超声提示肺动脉高压。胸部CT提示以两肺弥漫性磨玻璃样影为主要改变（图1，图2，图3，图4，图5，图6）。
图1 肺间质疾病患儿（例1）胸部CT图 1A：患儿入院时两肺透亮度减低，呈磨玻璃样改变；1B：泼尼松治疗1个半月患儿两肺磨玻璃影较前减少；1C：1年半后复查两肺透亮度不均匀减低，弥漫性分布磨玻璃密度影较前减少，左肺下叶背段可见多个含气囊腔
图2 肺间质疾病患儿（例2）胸部CT图 患儿8月龄，两肺弥漫磨玻璃状高密度影
图3 肺间质疾病患儿（例3）胸部CT图 患儿为11月龄女孩，双肺弥漫性磨玻璃密度影，区域性肺过度通气，左肺上叶支气管壁增厚，可见多发小囊状影，局部少量胸腔积液
图4 肺间质疾病患儿（例4）胸部CT图 患儿为3月龄男孩，两肺弥漫性点状高密度影
图5 肺间质疾病患儿（例6）胸部CT图 患儿为3月龄男孩，两肺各叶见片状磨玻璃状密度增高影
图6 肺间质疾病患儿（例7）胸部CT图 患儿为5月龄男孩，两肺透亮度减低，呈大片磨玻璃样改变；右肺中叶可见片状更高密度阴影，边界模糊
三、治疗及随访
7例患儿随访1个月~3年6个月，3例病情好转，3例死亡，1例失访。4例患儿单独使用糖皮质激素治疗，其中例1泼尼松治疗6个月后活动正常，不吸氧情况下经皮氧饱和度0.96~0.98；例2泼尼松治疗3个月后无气促，已经停止吸氧；例3应用泼尼松治疗2个月气促改善不明显，加用羟氯喹治疗后病情好转；例4、例5在分别应用泼尼松治疗2个月和4周后仍有气促、发绀、无法脱离氧气，分别在发病后3个月和5个月死亡；例6、例7未应用过糖皮质激素或羟氯喹治疗，例6仅应用氧疗及其他对症治疗，病情无改善，发病后5个月死亡，例7曾应用过阿奇霉素治疗2周，病情无改善，失访。
四、变异基因检测
7例患儿均存在SFTPC编码区Exon3上218位点的错义变异，其中例1~例5为c.218T>C，p.lle73Thr（第73号密码子的异亮氨酸变成苏氨酸，杂合变异，图7），为已知的致病性变异；例6、7为c.218T>A，p.Ile73Asn（第73号密码子的异亮氨酸变成天冬酰胺，纯合变异），经检索PubMed、人类基因组突变数据库、在线人类孟德尔遗传数据库、中国知网数据库和万方数据库，该变异尚未见报道。除存在SFTPC编码区218位点的错义变异外，6例患儿还检测到其他位点的错义变异（表3）。对3例患儿的10名家系成员进行了SFTPC基因检测，例1的父亲存在与例1相同位点的杂合变异c.218T>C（p.lle73Thr，I73T），且其胸部CT提示慢性肺炎改变，但临床症状不明显；例1的母亲，例3的姐姐、父母、爷爷、外公、外婆以及例5的父母均未检出SFTPC基因变异。
图7 肺间质疾病患儿基因测序图 箭头所指处为SFTPC基因编码区218位核苷酸T—C杂合变异（c.218T>C，p.lle73Thr），致73位异亮氨酸→苏氨酸改变
讨论
2001年Nogee等[9]报道了首例与SP-C基因变异相关的肺间质性疾病，患儿SP-C基因上的c.460+1 G→A杂合变异导致4号外显子的跳读以及表面活性蛋白C前蛋白（pro SP-C）C端区域37个氨基酸的缺失，患儿母亲具有相同的变异，随后其他SP-C基因变异陆续被报道。到目前为止，有超过50种引起儿童ILD的SP-C基因变异被发现，其中218位点上的I73T变异最常见，约占变异的25%~35%[5]。本组5例患儿为c.218T>C（p.lle73Thr，I73T）杂合变异，这是目前国外报道的热点变异；2例为SFTPC基因c.218T>A（p.Ile73Asn，I73A）（纯合变异），也是在218位点存在变异，只是氨基酸的变化不同，第73号密码子的异亮氨酸变成天冬氨酸，纯合变异，临床表现与其他5例患儿相似，因此高度怀疑c.218T>A（p.Ile73Asn，I73A）为致病性变异。
SFTPC基因缺陷的临床变异度大，可以引起多种表型，从新生儿期发病的呼吸窘迫综合征、婴儿期起病的慢性肺疾病到无症状的成人携带者[5]。本组7例患儿临床主要表现为咳嗽、低氧血症（气促、呼吸困难，氧依赖、三凹征、杵状指）、两肺可闻及湿性啰音，呈慢性病程，伴有生长受限；胸部CT示弥漫性磨玻璃样改变，抗感染治疗效果欠佳，符合婴幼儿期ILD的临床及影像学诊断标准。本组资料4例进行了支气管镜检查，但镜下均为支气管内膜炎症改变，2例支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）以组织细胞为主，2例以中性粒细胞为主，无特异性。本组患儿因诸多因素未进行肺活检。诚然病理-临床-影像诊断程序是目前国内外诊断ILD的公认标准，但婴幼儿ILD有着其特点，遗传因素占有重要的地位，近年来国外指南已经把基因诊断列为婴幼儿ILD的主要诊断手段之一，建议先于肺活检进行，尤其是临床及影像改变考虑为IESM的病例可以通过基因检测确诊，如基因无异常，才进行肺活检[10]。而且SFTPC基因变异所导致的肺间质疾病的病理改变多样化，特异性不强。但本组2例SFTPC基因c.218T>A为新发变异，如能有肺活检更具说服力。Kr?ner等[11]报道17例SFTPC变异的ILD患儿，其中8例为I73T变异，9例为其他位点变异，平均3年的随访结果显示：尽管8例I73T变异患儿应用了相同的经验性治疗（糖皮质激素、羟氯喹），最后的结局却不一样，1例临床症状消失，2例好转，4例病情无变化，1例恶化。本组4例3月龄内发病患儿中2例I73T变异、2例I73A变异；9月龄~2岁发病患儿3例均为I73T变异；需机械通气3例患儿中2例I73T变异，1例I73A变异；死亡3例中2例I73T变异，1例I73A变异，3例好转均为I73T变异，1例失访为I73A变异。从有限的文献报道及本组资料中未能发现SFTPC变异基因型与临床表型及预后的关系，但病例数少会对研究结果造成偏差，需更多病例的进一步研究。此外，本组中5例患儿合并SFTPC c.413C>A（p.Thr138Asn）变异，该变异在ClinVar数据库中显示为良性或可能良性变异。
还有哪些因素可影响SFTPC基因变异所致ILD患儿的临床经过及转归，目前尚未明了。
SFTPC基因缺陷可为新发变异或遗传性变异。Taam等[12]报道一家系中的5例I73T变异ILD患儿，其病情均好转。本组患儿中3例进行了家系调查，1例的父亲检测出与患儿存在相同的基因变异，其病情好转，2例患儿家系中未检测到SFTPC基因变异，1例病情好转，1例死亡。现有的研究未能够证实有阳性家族史的患儿其预后更差。关于SFTPC基因变异ILD患者复合ABCA3基因变异是否对其临床表型产生影响，国外有文献报道ABCA3变异可以影响SFTPC I73T变异婴儿ILD的严重程度[13,14]。本组7例患儿中，只有1例死亡患儿同时检测出ABCA3 c.2102G>A（p.Arg701Lys）及ABCA3 c.1942A>G（p.Met648Val）变异，而这两个位点变异不是目前报道的热点变异；其他2例死亡患儿无ABCA3基因变异。因此未能证实复合ABCA3基因变异会影响SFTPC基因变异ILD患者的预后。本组还有4例患儿合并SFTPB c.428C>T（p.Thr143Ile）变异，该变异在ClinVar数据库中显示为良性变异。
有文献报道，RSV感染可能对SFTPC变异所致ILD的轻重程度、起病时间、预后等有一定影响。Bullard和Nogee[13]报道的4例发病早、临床症状重的I73T变异患儿，3例考虑与ABCA3变异相关，1例患儿并未检测出ABCA3变异，但是存在早期RSV感染。Kr?ner等[11]报道的8例I73T患儿，4例RSV感染的ILD患儿与没有RSV感染的患儿相比病情更重。SP-C缺陷的小鼠在暴露于RSV后与对照组相比，出现了强烈的炎症反应和更严重的间质性肺疾病，恢复SP-C的表达可以减轻小鼠肺部的炎症反应[15,16]。但是本组7例患儿RSV检测均阴性，并没有证实RSV感染影响了SFTPC 218位点变异ILD婴儿的疾病进程。而3例死亡患儿的血清CMV-IgM或CMV-DNA均为阳性，好转的3例患儿的CMV-IgM或CMV-DNA均为阴性，是否CMV感染可能会影响SFTPC基因218位点变异ILD患儿的转归？目前国内外没有相关的报道，需要进一步的研究去证实。
对于SFTPC基因变异ILD患儿的治疗，目前都是基于病例报告，非对照研究，除了对症支持治疗：氧疗、积极抗感染，糖皮质激素、羟氯喹、阿奇霉素等药物对部分患儿可能有效，肺移植手术可以用于晚期的ILD患者[17,18]。有研究认为经羟氯喹治疗或羟氯喹联合糖皮质激素治疗的SFTPC基因I73T变异所致的ILD患儿，较单用全身糖皮质激素治疗患儿的症状改善更明显[11,19,20,21]。在本组4例患儿单纯应用糖皮质激素治疗，其中2例分别经过3个月和6个月的泼尼松治疗好转，2例患儿给予至少4周的泼尼松治疗效果并不理想，之后病情逐渐加重、死亡；1例泼尼松治疗无效后加用羟氯喹治疗数天后呼吸困难明显缓解；2例只采取氧疗及其他对症治疗，病情逐渐加重，1例死亡，1例失访。本研究结果与文献报道相似。
综上所述，与SFTPC基因218位点变异相关的婴幼儿肺间质性疾病的临床表现特异性不强，足月出生，慢性病程，反复咳嗽、气促、氧依赖、生长发育受限等是临床考虑SFTPC基因218位点变异相关性婴幼儿肺间质疾病的重要线索。该疾病的严重程度及转归可能受到病毒感染等因素影响。单纯的糖皮质激素治疗对于部分患儿可能作用有限，但由于缺少随机化或对照研究，难以准确地评估目前药物的疗效。因此，对于SFTPC基因变异所致婴幼儿ILD更深入的临床研究很有必要。
参考文献（略）
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