提高UBE2J1表达的物质在制备抗癌药物中的应用

　　提高ube2j1表达的物质在制备抗癌药物中的应用技术领域1.本发明属于肿瘤学、分子生物学及临床应用领域，具体涉及ube2j1表达载体的构建及提高ube2j1在肿瘤细胞内表达的过表达载体在制备抗癌药物中的应用。背景技术：[0002][0003]结直肠肿瘤的治疗方式包括内镜局部切除、根治性手术、术前新辅助放化疗、术后辅助放化疗、局部和转移性疾病的广泛手术、转移性肿瘤的局部消融治疗、姑息性化疗、靶向治疗和免疫治疗。尽管相关诊疗技术在近年来取得长足进展，但是由于结直肠癌在不同患者中具有高度的异质性，且多数患者初诊时肿瘤已处于中晚期，故结直肠癌的总体预后不佳。因此迫切需要探究结直肠癌发生发展机制，寻找介导结直肠癌进展的关键分子，为结直肠癌的靶向治疗提供新的靶点。[0004]泛素蛋白酶体系统的关键酶负责调控多种肿瘤进展过程，包括dna修复、细胞周期阻滞、细胞增殖、凋亡、血管生成、迁移侵袭、转移和耐药。这些关键酶包括泛素激活酶(e1)、泛素结合酶(e2)、泛素连接酶(e3)。其中，e2酶在泛素化系统中发挥核心作用。泛素结合酶e2j1(ube2j1)属于e2泛素结合酶家族。目前的研究表明ube2j1可以诱导多种底物蛋白的泛素化和降解。例如，ube2j1与c-iap1/traf2(tnf受体相关因子2)复合物相互作用，促进traf2泛素化；ube2j1联合e3连接酶hrd1介导mhc i的蛋白酶体降解；ube2j1/derlin-1/rma1复合物可催化错误折叠的cftr(囊性纤维化跨膜电导调节剂)泛素蛋白酶体降解。上述研究表明ube2j1在内质网相关蛋白降解中发挥关键作用。此外，ube2j1能促进irf3(转录因子ifn调控因子3)泛素化，通过负向调控ⅰ型ifn表达促进rna病毒感染。[0005]结直肠癌的全身治疗药物主要包括奥沙利铂、氟嘧啶(氟尿嘧啶或卡培他滨)、伊立替康等化疗药物。近年来肿瘤靶向治疗相关的研究方兴未艾，并逐渐应用于临床实践。目前针对结直肠癌的靶向药物研究主要集中在抗vegf单克隆抗体(如贝伐单抗)、抗egfr单克隆抗体(如西妥昔单抗或帕尼单抗)、酪氨酸激酶抑制剂(如瑞格非尼)。而针对促ube2j1表达的物质在制备治疗结直肠癌药物中的应用尚无研究报道。技术实现要素：[0006]针对上述问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤抑制蛋白ube2j1用以制备抑制结直肠癌细胞增殖及转移的药物，为抗结直肠癌药物研发提供新的靶点。[0007]为实现上述发明目的，本技术提供了以下技术方案：[0008]首先，本技术提供了提高泛素结合酶e2j1(ube2j1)表达的物质在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的抗肿瘤药物优选抑制结直肠癌细胞增殖及转移的药物，进一步优选靶向药物。[0009]进一步，上述“提高泛素结合酶e2j1(ube2j1)表达的物质”优选ube2j1过表达载体，即ube2j1过表达载体在制备抗肿瘤药物中的用途，特别是在制备抗结直肠癌靶向药物中的应用。[0010]上述“ube2j1过表达载体”是指利用常规技术构建的促泛素结合酶e2j1表达的载体，如本技术的一个实施例中，所使用的ube2j1过表达载体是利用慢病毒载体构建的ube2j1稳定转染株，可以促进ube2j1在肿瘤细胞中的表达，进而抑制结直肠癌细胞增殖及转移。其它真核表达载体如质粒载体、腺病毒载体以及腺相关病毒载体等常规载体也可以用于构建ube2j1过表达载体，构建过表达载体的方法为本领域常规技术，如文献“ube2o targets mxi1 for ubiquitination and degradation to promote lung cancer progression and radioresistance”所述。[0011]其次，本技术还提供了一种含有促泛素结合酶e2j1(ube2j1)表达物质的抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物还包括药学上可接受的赋型剂，并配置成药学领域常规的制剂，例如锭剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、混悬剂等口服给药剂型或非口服给药制剂。进一步而言，所述“促泛素结合酶e2j1(ube2j1)表达物质”优选ube2j1过表达载体；所述抗肿瘤药物优选抑制结直肠癌细胞增殖及转移的药物，如抑制结直肠癌细胞增殖及转移的靶向药物。[0012]本技术应用细胞生物学及分子生物学技术，首次在实验中发现ube2j1在结直肠癌旁正常组织、肿瘤原发灶及肝转移灶中表达量逐渐降低，并且ube2j1基因启动子区高甲基化介导了ube2j1的沉默。并首次在体内外利用ube2j1的过表达载体实验证实ube2j1能够抑制结直肠癌细胞增殖及转移。因此，将ube2j1作为抗肿瘤治疗的靶点开发抗癌药物，对肿瘤的靶向治疗具有重要的意义。附图说明[0013]图1为ube2j1的筛选过程，及ube2j1在结直肠癌组织及细胞系的表达示意图；[0014]图中，lm表示结直肠癌肝转移组织，tumor表示肿瘤组织，n表示癌旁正常组织。图2为利用emboss网站预测的ube2j1启动子区cpg岛范围示意图。[0015]图3为正常肠上皮细胞系ncm460以及不同结直肠癌细胞系的ube2j1表达量及表达量回复的rtpcr检测结果。[0016]图4为msp方法对ube2j1启动子区甲基化水平定性的分析结果。[0017]图5为bsp方法对ube2j1启动子区甲基化水平进行的定量分析结果。[0018]图6为cck-8实验中不同处理组od值的统计分析结果。[0019]图7为集落形成实验照片和不同处理组集落形成数统计结果。[0020]图8为不同细胞迁移(migration)及侵袭(invasion)能力的检测结果。[0021]图9为不同处理组裸鼠皮下荷瘤实验的大体照片及肿瘤体积、重量的统计结果。[0022]图10为不同处理组肝、肺转移模型中的肝、肺大体照片及转移瘤形成数目的统计分析结果。具体实施方式[0023]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。[0024]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。[0025]以下实施例中所用的组织样本来自申请人结直肠癌手术患者，病人及家属术前被充分告知研究目的及流程，并签署知情同意书。本研究已通过本单位伦理委员会的批准。[0026]所用的结直肠癌细胞系dld-1、lovo、sw620、sw480、caco2、ht-29、hct 116及正常肠上皮细胞系ncm460均购自于上海细胞库；[0027]所用的细胞培养基：dmem/f12中加入终浓度为10％胎牛血清、终浓度为1％的青霉素以及终浓度为1％链霉素。所涉及试剂均购自维森特生物技术公司。[0028]实施例中涉及的无血清培养基即为dmem/f12培养基。[0029]实验中所用的慢病毒、质粒均购自上海和元生物公司。[0030]实施例1：筛选肿瘤抑制基因ube2j1，ube2j1在结直肠癌中的表达差异及临床病理相关性[0031]本实施例通过3:3:3配对的正常肠组织、结直肠癌原发灶及肝转移灶进行蛋白组学分析，发现ube2j1蛋白表达量在正常肠组织、结直肠癌原发灶和肝转移灶中依次下调。[0032]实施例收集了24个结直肠癌病人的癌旁正常组织、肿瘤原发灶及肝转移灶进行ube2j1表达量分析。提取上述组织的rna，并运用qrt-pcr法验证ube2j1表达量。同时进一步扩大样本量运用200例结直肠癌组织和癌旁正常组织验证ube2j1表达量。[0033]具体方法如下：[0034]向收集的标本中加入1ml trizol(invitrogen公司)和数颗组织研磨珠，在组织匀浆机中研磨，抽提总rna，逆转录合成cdna。以cdna为模板，加入相应目的基因引物和qrt-pcr试剂(takara biotechnology)进行pcr。采用biorad(cfx96)荧光定量pcr仪上进行检测。以gapdh作为内参基因用于目的基因的半定量。[0035]人ube2j1引物序列(引物由上海捷瑞生物设计并合成)：[0036]human ube2j1 forward:5'-ttgaatggcacttcacggttag-3',(seq id no.1)[0037]human ube2j1 reverse:5'-ttcatgggatactctggtggc-3'，(seq id no.2)[0038]人gapdh引物序列(引物由上海捷瑞生物设计并合成)：[0039]human gapdh forward:5'-ggacctgacctgccgtctag-3',(seq id no.3)[0040]human gapdh reverse:5'-gtagcccaggatgcccttga-3'，(seq id no.4)[0041]实时荧光定量pcr反应程序：95℃ 5min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，扩增30个循环。采用2^(?△ct)法计算ube2j1的相对表达量。[0042]根据ube2j1表达量将200例病人分为高表达组和低表达组，而后进行临床病理学资料的相关性分析(年龄、性别、肿瘤大小、t分级、tnm分期、淋巴结转移、远处转移及cea水平)，结果如下表1所示。[0043]表1ube2j1表达与患者临床病理因素的相关性(n＝200)[0044][0045][0046]说明：cea：癌胚抗原；[0047]p《0.05认为差异有统计学意义。粗体表示p值＜0.05[0048]图1为ube2j1的筛选过程、ube2j1在结直肠癌组织及细胞系的表达情况示意图。图1中，a为基于蛋白组学数据绘制的肿瘤组织(t)与癌旁正常组织(n)火山图；b为基于蛋白组学数据绘制的肿瘤组织(t)与结直肠癌肝转移组织(m)火山图；c为24例结直肠癌肝转移病人癌旁正常组织(normal)、肿瘤组织(tumor)、结直肠癌肝转移组织(lm)中ube2j1表达检测结果；d为200例结直肠癌病人肿瘤组织(tumor)及癌旁正常组织(normal)中ube2j1表达量检测结果；e为正常肠上皮细胞系ncm460以及不同结直肠癌细胞系dld-1、lovo、sw620、sw480、caco-2、ht-29、hct 116中ube2j1表达量的检测结果。[0049]基于表1和图1的上述实验可以得出结论：与癌旁正常组织相比，ube2j1的表达量在结直肠癌组织及细胞系均下调，并且其表达量与肿瘤大小、t分级、tnm分期、淋巴结转移及远处转移负相关。[0050]本实施例涉及的qrt-pcr实验为本领域常规实验方法，如文献“real-time reverse transcription pcr(qrt-pcr)and its potential use in clinical diagnosis”所公开。[0051]实施例2：ube2j1在结直肠癌中低表达是由其启动子区高甲基化介导验证试验[0052]实施例1验证了ube2j1在结直肠癌中表达下调，本实施例进一步验证ube2j1启动子区高甲基化介导自身表达量降低。具体实验步骤如下：[0053](1)利用甲基化分析网站emboss发现ube2j1启动子区存在一个长度为652bp cpg岛。[0054]如图2所示，图2中，a为cpg岛中cpg二核苷酸的出现率(观测值与期望值的比率)；b为cpg岛的gc含量；c为cpg岛的核苷酸序列长度。[0055](2)体外在5％co2、37℃条件下用含10％胎牛血清的dmem(购自维森特生物技术公司)培养结直肠癌细胞系，细胞融合度达30％时加入终浓度为2μm甲基化抑制剂5-aza(sigma公司)，同时设置不加5-aza的对照组，每日给细胞换液并补充等量5-aza，至细胞长满。提取加药组和对照组细胞rna，加入相应目的基因引物、样本rna及一步法rt-pcr试剂盒组分(vazyme公司),pcr产物进行琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察电泳结果，凝胶图像分析系统成像，分析ube2j1相对表达量。[0056]ube2j1和gapdh引物序列同seq id no.1,seq id no.2,seq id no.3,seq idno.4。rt-pcr反应程序：50℃ 30min,94℃ 3min,94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,扩增30个循环，72℃ 7min,4℃,hold。[0057]正常肠上皮细胞系ncm460以及不同结直肠癌细胞系dld-1、lovo、sw620、sw480、caco-2、ht-29、hct 116中ube2j1的检测结果如图3所示(图3中gapdh为内参基因)。以上rt-pcr方法验证结直肠癌细胞系中ube2j1的低表达是由启动子区高甲基化介导的。[0058](3)甲基化特异性pcr(msp)验证结直肠癌细胞系中ube2j1启动子区甲基化程度。结直肠癌细胞系经抽提基因组dna，亚硫酸盐处理，dna修饰后纯化回收，pcr扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测细胞系ube2j1启动子区甲基化程度。[0059]msp(甲基化特异性pcr)具体实验步骤：[0060]1、细胞系基因组dna提取：采用dneasy blood&tissue kit(qiagen公司)抽提细胞系dna。[0061]2、亚硫酸氢钠处理基因组dna[0062]1)1.5ml离心管中双蒸水稀释2μgdna至50μl；[0063]2)加5.5μl新鲜配制的3m naoh，混匀；[0064]3)42℃水浴30min；[0065]4)加入30μl 10mm氢醌至上述水浴后混合液中，溶液颜色转为淡黄色；[0066]5)轻轻摇匀，加入520μl 3.6m亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中,配置方法：1.88g亚硫酸氢钠使用双蒸水稀释，并以3m naoh滴定溶液至ph 5.0,最终体积为5ml；[0067]6)ep管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；[0068]7)加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；[0069]8)50℃避光水浴16h。[0070]3、修饰后dna纯化回收[0071]1)移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlep管中；[0072]2)以下使用promega wizard cleanup dna纯化回收系统(promega，a7280)[0073]a.70℃水浴预热双蒸水，配制80％异丙醇；[0074]b.加1ml promega’s wizard dna clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使dna充分与树脂结合；[0075]c.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml ep管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积；[0076]d.将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤；[0077]e.将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净ep管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后dna处于与树脂结合状态；[0078]f.将小柱取下置于另一洁净1.5ml ep管上，移液器加50ul预热好的双蒸水，室温放置5min；[0079]g.离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时ep管内液体即为洗脱的修饰后dna溶液，终体积为50μl；[0080]3)加5.5μl新鲜配制的3m naoh，室温放置15min；[0081]4)加33μl 10m乙酸铵，以中和naoh，使溶液ph于7.0左右；[0082]5)加4μl 10mg/ml糖原，作为沉淀指示剂；[0083]6)加270μl冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀；[0084]7)4℃，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀；[0085]8)加500μl 70％乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜ep管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次；[0086]9)倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离心至ep管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入30μl双蒸水，溶解沉淀；[0087]10)-20℃保存dna溶液。[0088]4、修饰后dna的pcr反应[0089]1)反应体系：模板dna 1μl，甲基化或未甲基化引物f、r各0.5μl，10×buffer2.5μl，2.5mm dntp 4μl，taq酶(takara公司)0.25μl,ddh2o补齐至25μl；2)反应条件：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s,扩增30个循环，72℃3min，10℃，保存。[0090]ube2j1的msp引物序列：[0091]methylated forward primer:5'-agggtcgggacgagaggacgag-3'(seq id no.5)；methylated reverse primer:5'-ccaaccctaccgcgaccgcccgactt-3'(seq id no.6)；[0092]unmethylated forward primer:5'-agggttgggatgagaggatgaggatg-3'(seq id no.7)；unmethylated reverse primer:5'-acccaaccctaccacaaccacccaactta-3'(seq id no.8)。[0093]5、电泳鉴定：pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳后观察条带，[0094]图4为msp方法对ube2j1启动子区甲基化水平定性的分析结果。[0095](4)亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)验证结直肠癌细胞系中ube2j1启动子区cpg岛甲基化位置及程度。[0096]结直肠癌细胞系dld-1、lovo、ht-29、hct 116经抽提基因组dna，亚硫酸氢盐处理，dna修饰后纯化回收，pcr扩增后，将目的产物纯化后进行ta克隆，每个克隆挑取阳性克隆测序，最后将测得的序列与ube2j1启动子区的原始序列比对，统计甲基化位点及数量，分析ube2j1甲基化程度。[0097]本实验中pcr扩增后的产物ta克隆及测序由北京睿博兴科生物科技公司完成。[0098]ube2j1的bsp引物序列(引物设计及合成均由北京睿博兴科生物科技公司完成)：forward primer：5'-gtagttggagtttggtgttttttt-3'(seq id no.9)；[0099]reverse primer：5'-tgatgtgggggtggagggatttatggattg-3'(seq id no.10)。[0100]图5为bsp方法对ube2j1启动子区甲基化水平进行定量分析的结果，其中，a-d依次为dld-1、ht-29、lovo、hct 116的甲基化水平进行定量分析结果。[0101]由图2-图5的实验得出结论：ube2j1低表达的细胞系启动子区甲基化水平高，反之亦然。[0102]实施例3：体外实验验证ube2j1对结直肠癌进展的抑制作用[0103]本实施例具体步骤如下：[0104](1)构建ube2j1敲低及过表达的慢病毒载体，然后分别转染入dld-1、lovo、ht-29、hct 116细胞系中。实验中ube2j1敲低及过表达慢病毒均由上海和元生物提供，稳转株构建及嘌呤霉素筛选均按照上海和元生物提供的慢病毒操作手册进行。上述bue2j1敲低或过表达稳定转染株构建方法如下：[0105]1、慢病毒转染前24h，将结直肠癌细胞以15万/孔铺到6孔板中，使细胞在慢病毒转染时的密度为20％-30％；[0106]2、第二天，用含有7.5μg/ml polybrene的1ml新鲜培养基替换原培养基，加入200μl病毒悬液。37℃孵育。[0107]3、4h后加入1ml新鲜培养基以稀释polybrene。[0108]4、继续培养24h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。[0109]5、继续培养,细胞长满后转至大皿，转染后3-4天开始加嘌呤霉素筛选带抗性的细胞。同时设置野生型对照组细胞系，嘌呤霉素从1μg/ml逐渐增大(抗生素梯度每次换液增加1μg/ml)直至野生型细胞全部杀灭，再降低嘌呤霉素浓度至1μg/ml。转染病毒成功的结直肠癌细胞系用于后续体内外功能实验。[0110]上述步骤中的polybrene和嘌呤霉素均购自碧云天生物技术公司。细胞培养基为dmem/f12或1640培养基购自维森特生物技术公司。[0111]以上慢病毒构建方法为常规方法，如文献“circular rna circ-donson facilitates gastric cancer growth and invasion via nurf complex dependent activation of transcription factor sox4”所公开的方法。[0112](2)cck-8及集落形成实验验证ube2j1对结直肠癌增殖能力的影响[0113]1)cck-8实验构建ube2j1敲低及过表达的慢病毒载体[0114]取上述处于对数生长期的ube2j1敲低及过表达稳转株，消化细胞混匀计数，在96孔板中以2000个细胞/250μl dmem/f12或1640完全培养基(上述培养基均购自维森特生物技术公司)接种细胞，每个处理组设置3个副孔。24h后，移去培养液，每孔加100μl(90μl裸培+10μl cck-8溶液)，细胞培养箱中孵育2h，用酶标仪测定450nm处的吸光度值记录读数。连测5天绘制折线图。cck-8试剂盒购自碧云天生物科技公司。[0115]检测结果如图6所示，图6中，a-d分别为dld-1、lovo、ht-29、hct 116细胞系的od值。图6中，sh-nc即转染了对照的慢病毒，作为sh-ube2j1组别的对照组；sh-ube2j1即转染了ube2j1干扰的慢病毒，用于验证在肿瘤细胞中下调ube2j1表达量对结直肠癌恶性生物学行为的影响。vector即转染了空载的慢病毒，作为ube2j1过表达组别的对照组；ube2j1即转染了ube2j1过表达的慢病毒，用于验证在肿瘤细胞中上调ube2j1表达量对结直肠癌恶性生物学行为的影响。后续的体外实验(cck-8、集落形成实验、transwell实验)及体内实验(裸鼠皮下荷瘤及肝肺转移模型)均由上述稳定转染ube2j1敲低及过表达慢病毒的结直肠癌细胞系(dld-1、lovo、ht-29、hct 116)实施。[0116]由图6可见敲低ube2j1显著增强了dld-1和lovo的增殖能力，而过表达ube2j1显著抑制ht-29和hct 116的增殖能力。[0117]2)集落形成实验[0118]取上述步骤1)处于对数生长期的稳转株，消化计数，在6孔板中以800细胞/孔的密度接种细胞，每个处理组设3个副孔，混匀。放入培养箱培养14天，每3天换液一次。14天后弃去培养基，用pbs清洗两遍，每孔加入75％酒精固定2分钟。最后吸弃酒精，用结晶紫染色20分钟，观察集落形成情况。[0119]检测结果如图7所示，图7中，a为dld-1、lovo细胞系集落形成实验照片；b为不同处理组dld-1、lovo集落形成数统计结果；c为ht-29、hct 116细胞系集落形成实验照片；d为不同处理组c为ht-29、hct 116集落形成数统计结果。图7集落形成实验结论与图6的cck-8结果类似，进一步证明了ube2j1能够抑制结直肠癌细胞的增殖能力。[0120](3)transwell实验验证ube2j1对结直肠癌细胞迁移侵袭能力的影响1)transwell实验[0121]将3×104/孔上述步骤1)处于对数生长期的稳转株悬浮于200μl无血清培养基中，并接种到含有未铺或铺有基质胶的上室中，然后将完全培养基(700μl)加入下室中。培养箱中孵育48小时后，使用0.1％结晶紫染色侵袭或迁移至底层膜的细胞。棉签轻轻擦去上室中未侵袭或迁移的细胞，风干后在显微镜下进行观察拍照，并分析结果。(上述培养基包含dmem/f12或1640培养基均购自维森特生物技术公司)[0122]图8为不同细胞迁移(migration)及侵袭(invasion)能力的检测结果，图8中，a、c、e、g依次为dld-1、lovo、ht-29、hct 116细胞系显微镜照片；b、d、f、h依次为dld-1、lovo、ht-29、hct 116细胞系三次重复试验后不同处理组显微镜图片视野下迁移侵袭的细胞数目统计结果。[0123]本实施例实验结果证明：ube2j1能够抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。[0124]实施例4：体内实验验证ube2j1对结直肠癌进展的抑制作用[0125]本实施例在实施例3体外实验的基础上进一步验证ube2j1在体内环境下对结直肠癌细胞增殖及转移能力的影响。本技术中的动物实验均已通过本单位动物伦理委员会的审批。具体实施步骤如下：[0126]1)裸鼠皮下荷瘤实验：从南京医科大学动物中心购买5周龄大小的雄性balb/c裸鼠，饲养于动物中心。[0127]将实施例3步骤(1)中通过慢病毒载体构建的ube2j1敲低及过表达的稳定转染的细胞株dld-1和hct116取出，将培养液吸弃，用pbs清洗两遍后用胰酶消化细胞，将细胞转移至10ml ep管中，后放入离心机离心，离心完成后弃上层培液。用pbs重悬细胞，并计数，调整细胞终浓度为1x106个细胞/100μl。在裸鼠的左右腹股沟皮下注射100μl细胞悬液。每5天测量肿瘤体积和重量，以公式体积＝0.5×长×宽2来计算肿瘤的体积。25天后处死裸鼠，获得小鼠肿瘤样本。拍照记录后将肿瘤样本进行保存。[0128]肿瘤样本如图9所示，其中，a为sh-nc和sh-ube2j1#1组的肿瘤照片，b为sh-nc和sh-ube2j1#1组的肿瘤体积统计结果；c为sh-nc和sh-ube2j1#1组的肿瘤重量统计结果；d为vector和ube2j1组的肿瘤照片；e为vector和ube2j1组的肿瘤体积统计结果；f为vector和ube2j1组的肿瘤重量统计结果。[0129]sh-nc即转染了对照的慢病毒，作为sh-ube2j1组别的对照组；sh-ube2j1#1即转染了ube2j1干扰的慢病毒，用于验证在结直肠癌细胞系dld-1中下调ube2j1表达量对结直肠癌增殖能力的影响；结果显示下调ube2j1表达显著促进肿瘤细胞增殖能力。vector即转染了空载的慢病毒，作为ube2j1过表达组别的对照组；ube2j1即转染了ube2j1过表达的慢病毒，用于验证在结直肠癌细胞系hct116中上调ube2j1表达量对结直肠癌增殖能力的影响；结果显示上调ube2j1表达显著抑制肿瘤细胞增殖能力。[0130]以上小鼠实验证明ube2j1在体内环境下能够有效延缓结直肠癌细胞的生长，肿瘤重量也显著减轻。[0131]2)肝肺转移实验：[0132]本实验以5周龄大小的雄性balb/c裸鼠为实验对象，将不同稳定转染处理之后的细胞消化重悬，制成终浓度为1x106个细胞/100μl的细胞悬液。将100μl上述细胞悬液通过1ml注射器注入裸鼠脾尖或者通过尾静脉注入血液循环，4周后处死裸鼠，解剖裸鼠肝脏和肺脏，观察肝肺转移瘤形成情况，拍照记录后将肿瘤样本进行保存。[0133]试验结果如图10所示，其中，a为肝转移处理组结直肠癌细胞系dld-1和hct 116中sh-nc、sh-ube2j1#1、ube2j1、vector组的肿瘤照片，b为肺转移处理组结直肠癌细胞系dld-1和hct 116中sh-nc、sh-ube2j1#1、ube2j1、vector组的肿瘤照片；c为肝转移处理组对应的转移瘤形成数目的统计分析结果；d为肺转移处理组对应的转移瘤形成数目的统计分析结果；图中，sh-nc即转染了对照的慢病毒，作为sh-ube2j1组别的对照组；sh-ube2j1#1即转染了ube2j1干扰的慢病毒，用于验证在结直肠癌细胞系dld-1中下调ube2j1表达量对结直肠癌肝肺转移能力的影响；结果显示下调ube2j1表达显著促进肿瘤细胞肝肺转移能力。vector即转染了空载的慢病毒，作为ube2j1过表达组别的对照组；ube2j1即转染了ube2j1过表达的慢病毒，用于验证在结直肠癌细胞系hct116中上调ube2j1表达量对结直肠癌肝肺转移能力的影响。[0134]以上小鼠实验证明上调ube2j1在体内环境下的表达量能够显著抑制结直肠癌细胞的肝肺转移能力。[0135]以上实施例说明本发明提供的蛋白ube2j1能够抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为，可应用于制备结直肠癌靶向药物。本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。